北方冬麥區(qū)小麥春化基因的組成與分布及其與冬春性的關(guān)系

趙 杰，劉洪泉，趙 蕓，楊 鍇，3，傅永斌，顧玉章，孫麗靜，胡夢(mèng)蕓，李 輝，張穎君

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；2.河北宏瑞種業(yè)有限公司，河北 石家莊 050035；3.河北工程大學(xué) 園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；4.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 張家口 075000)

小麥春化作用是指經(jīng)過適宜的低溫處理從而啟動(dòng)或促進(jìn)小麥開花的現(xiàn)象[1-2]。根據(jù)小麥春化過程中對(duì)低溫的需求強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，將其劃分為強(qiáng)冬性、冬性、半冬性、弱冬性、弱春性和春性[3-4]。

小麥的春化作用主要由VRN1[5-6]、VRN2[7-8]、Vrn-B3[9]和Vrn-D4[10]基因控制。其中，VRN1位點(diǎn)包括Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D13個(gè)同源基因，分別位于小麥5A、5B、5D染色體上[11]，這3個(gè)同源基因中任意一個(gè)基因?yàn)轱@性時(shí)，小麥的發(fā)育特性即為春性[12]，且顯性等位基因Vrn-A1的效應(yīng)強(qiáng)于Vrn-B1和Vrn-D1[11]。VRN2位點(diǎn)位于小麥5A染色體[7]，該位點(diǎn)包括2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的基因ZCCT1和ZCCT2[8，13]。VRN2可以調(diào)控VRN1和Vrn-B3的表達(dá)[9]。利用中國(guó)春的染色體置換系群體，在小麥7B染色體短臂上定位到控制春化作用的基因Vrn-B3[9]，該基因是擬南芥FLOWERINGLOCUST的同源基因，其顯性等位基因促進(jìn)小麥開花，參與小麥春化途徑的支路[9]。Vrn-D4位于小麥5D染色體短臂上，通過與VRN1和Vrn-B3的互作參與調(diào)控小麥的春化進(jìn)程[10]。研究表明，VRN1是小麥春化過程中的關(guān)鍵基因[14]，且對(duì)VRN2基因具有顯性上位作用[15]。當(dāng)3個(gè)VRN1基因全為隱性，且VRN2為顯性等位基因時(shí)，小麥發(fā)育特性為春性[15]。

北方冬麥區(qū)由北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)組成，是我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)[16-17]。北部冬麥區(qū)主要包括遼寧省南端、北京、天津、河北省長(zhǎng)城以南與保定和滄州以北地區(qū)、山西省中部與東南部、陜西省北部和甘肅省隴東地區(qū)；黃淮冬麥區(qū)包括山東、河南、河北省中南部、陜西關(guān)中平原、山西省南部、甘肅省天水市及平?jīng)雠c定西區(qū)域、江蘇和安徽省的淮河以北區(qū)域[18-19]。北方冬麥區(qū)約占全國(guó)小麥總產(chǎn)的75%左右[19]，保障該麥區(qū)的小麥產(chǎn)量對(duì)我國(guó)糧食生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。

本研究以271份北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)小麥品種為試驗(yàn)材料，研究4個(gè)主效春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B3的組成特點(diǎn)，闡明兩大冬麥區(qū)VRN基因組成與小麥冬春性的關(guān)系，旨在為小麥品種遺傳改良提供理論支撐，對(duì)小麥生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以北方冬麥區(qū)271份小麥主栽品種(包括北京14份、天津1份、河北79份、河南71份、山東57份、山西24份、陜西15份、甘肅1份、江蘇9份)為試驗(yàn)材料進(jìn)行4個(gè)春化基因的分子標(biāo)記檢測(cè)。

1.2 小麥材料田間表型鑒定和冬春性確定

將這271份小麥品種于2020年12月初播種于河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所三亞試驗(yàn)站，2021年1月下旬調(diào)查記錄田間抽穗情況。當(dāng)?shù)貧鉁財(cái)?shù)據(jù)于2345天氣預(yù)報(bào)網(wǎng)(http：//tianqi.2345.com/)進(jìn)行查詢。同時(shí)，結(jié)合中國(guó)作物種質(zhì)信息網(wǎng)(https：//www.cgris.net/)和《中國(guó)小麥遺傳資源目錄》的查詢結(jié)果確定檢測(cè)小麥材料的冬春性。

1.3 小麥基因組DNA提取和春化基因檢測(cè)

利用CTAB法提取小麥葉片基因組DNA。春化基因的序列特異性檢測(cè)參照Yan等[20]、Fu等[21]和Yan等[9]的方法。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，引物序列見表1。序列擴(kuò)增試劑采用康為世紀(jì)生物科技股份有限公司(https：//www.cwbio.com/home)的2×Es Taq MasterMix，PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50～61 ℃退火30～60 s，72 ℃延伸1～2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)利用1%或2%的瓊脂糖凝膠電泳，200 V電壓電泳30 min，緩沖體系為1×TAE溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種VRN基因的顯隱性分析

2.1.1Vrn-A1基因檢測(cè)結(jié)果 利用引物VRN1AF和VRN1-INT1R對(duì)271份小麥品種的基因組DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，結(jié)果顯示，所有品種均能擴(kuò)增出734 bp的片段，表明這些品種不含Vrn-A1a或Vrn-A1b等位變異。進(jìn)一步利用引物Intr1/A/F2和Intr1/A/R3對(duì)這些小麥品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所有小麥品種均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而利用引物Intr1/C/F和Intr1/AB/R均可擴(kuò)增出1 068 bp的特異性片段，推斷供試小麥品種中Vrn-A1第1內(nèi)含子區(qū)域均不含大片段缺失，其Vrn-A1的基因型為隱性vrn-A1。由此表明，271份小麥品種只含有隱性基因vrn-A1。

表1 小麥春化基因檢測(cè)相關(guān)引物Tab.1 Primers used for detection of genes responding to vernalization of wheat

2.1.2Vrn-B1基因檢測(cè)結(jié)果 本研究利用引物組合Intr/B/F、Intr1/B/R3和Inr/B/F、Inr1/B/R4對(duì)271份小麥品種的Vrn-B1基因組成進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，有8份品種(豫麥34、鄭麥9023、先麥10號(hào)、豐川6號(hào)、科信9號(hào)、陜253、陜農(nóng)78和西農(nóng)538)利用引物Intr/B/F和Intr1/B/R3可以擴(kuò)增出709 bp片段，而引物Inr/B/F和Inr1/B/R4未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，表明這8份品種含有顯性基因Vrn-B1，占供試品種的3.0%。而其余小麥品種只有引物Inr/B/F和Inr1/B/R4可以擴(kuò)增出1 149 bp片段，引物Intr/B/F和Intr1/B/R3未擴(kuò)增出條帶，表明這些品種含有隱性基因vrn-B1(占97.0%)。

2.1.3Vrn-D1基因檢測(cè)結(jié)果 利用引物Intr/D/F和Intr1/D/R3對(duì)這271份小麥品種進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，有75份小麥材料可以擴(kuò)增出1 671 bp特異性條帶，而引物Intr/D/F和Intr1/D/R4未擴(kuò)增出條帶，表明這些小麥品種含有顯性基因Vrn-D1(占27.7%)。其余的196份小麥材料檢測(cè)結(jié)果正好相反，表明這些材料含有隱性基因vrn-D1(占72.3%)。

2.1.4Vrn-B3基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)271份小麥材料Vrn-B3位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有品種利用引物VRN4-B-INS-F和VRN4-B-INS-R均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而引物VRN-4-B-NOINS-F和VRN-4-B-NOINS-R都擴(kuò)增出1 140 bp特異性條帶，表明這些材料均含有隱性基因vrn-B3。

2.2 小麥品種不同春化基因的組合和分布情況

通過分析供試小麥材料春化基因顯性位點(diǎn)的分布情況，表明顯性等位基因Vrn-D1分布頻率最高，為27.7%；顯性等位基因Vrn-B1分布頻率僅為3.0%；所檢測(cè)材料中均不含顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B3(表2)。以上結(jié)果表明，供試小麥品種中控制春化作用的顯性等位基因主要是Vrn-D1，其中在江蘇小麥品種中分布頻率最高(88.9%)，其次為河北小麥品種(38.0%)、陜西小麥品種(33.3%)、河南小麥品種(31.0%)、山西小麥品種(12.5%)、山東小麥品種(10.5%)、北京小麥品種(7.1%)。顯性等位基因Vrn-D1在北方冬麥區(qū)分布頻率呈現(xiàn)由黃淮冬麥區(qū)向北部冬麥區(qū)、由南向北逐漸減少的趨勢(shì)。顯性等位基因Vrn-B1只有在3個(gè)省份的小麥材料中檢測(cè)到，分布頻率為陜西最高(20.0%)，其次依次為河南(4.2%)、山東(3.5%)。所檢測(cè)小麥材料中甘肅和天津的品種各有1份，均不含顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1。

表2 顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1在不同省份小麥品種中的分布Tab.2 Distribution of dominant alleles Vrn-B1 and Vrn-D1 in wheat varieties of different provinces

該271份小麥材料共檢測(cè)到春化基因4種組合，分別為vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3、vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3、vrn-A1/Vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3、vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3。所檢測(cè)小麥材料中基因型為vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3的品種有190份，其次依次是基因型為vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3的品種(73份)、基因型為vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3的品種(6份)，基因型為vrn-A1/Vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3的品種只有2份。

2.3 北方冬麥區(qū)小麥春化基因組成與冬春性的相關(guān)性分析

2020年12月將這271份小麥材料播種于海南省三亞市，2021年1月調(diào)查田間抽穗情況。該生長(zhǎng)周期，三亞市最低氣溫高于11℃(圖1)，因此，田間正常抽穗的品種為春性小麥。

圖1 三亞市氣溫變化Fig.1 Temperature change in Sanya City

進(jìn)一步結(jié)合資料記載和表型調(diào)查結(jié)果，所檢測(cè)材料中偏冬性和半冬性品種最多，有184份，其次依次為冬性品種(53份)、弱春性品種(15份)、弱冬性品種(10份)，春性品種只有9份。

通過分析春化基因與小麥冬春性的關(guān)系，顯示在含有顯性春化基因Vrn-B1的8份品種中，半冬性品種3份、弱春性2份、春性3份，Vrn-B1基因型推測(cè)的表現(xiàn)型與冬春性的一致性為62.5%(表3)。含有顯性春化基因Vrn-D1的品種冬春性記載以半冬性為最多(53份)，其次為冬性(8份)、弱春性(7份)、春性(6份)、弱冬性(1份)，Vrn-D1基因型推測(cè)的表現(xiàn)型與冬春性的一致性僅為17.3%(表3)。供試小麥材料主效春化基因組成為全隱性(即基因型為vrn-A1/vrnB1/vrn-D1/vrn-B3)，冬春性記載中半冬性和偏冬性為最多(129份)，其次為冬性(45份)、弱冬性(9份)、弱春性(6份)，春性品種有1份，基因型推測(cè)的表現(xiàn)型與冬春性的一致性為96.3%。

以上結(jié)果表明，顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1推測(cè)的表現(xiàn)型與冬春性的一致性較低，隱性等位基因組合vrn-A1/vrn-B1/vrnD1/vrn-B3推測(cè)的表現(xiàn)型與記載的冬春性一致性較高。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1對(duì)小麥的春化作用較弱，或在這些小麥材料中含有其他未檢測(cè)的春化基因。

表3 顯性等位基因Vrn-B1和Vrn-D1在不同冬春性品種中的分布Tab.3 Distribution of dominant Vrn-B1 and Vrn-D1 allele in different winterness-springness types

3 結(jié)論與討論

Yan等[6]通過利用單粒春小麥G2528和冬小麥G1777構(gòu)建F2群體，發(fā)現(xiàn)VRN1與編碼MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的基因AP1和AGLG1完全連鎖。進(jìn)一步通過序列分析，發(fā)現(xiàn)AP1啟動(dòng)子區(qū)的自然變異導(dǎo)致小麥的冬春特性不同[6]，并根據(jù)其啟動(dòng)子區(qū)的序列差異開發(fā)出Vrn-A1基因在六倍體冬小麥和春小麥中的特異性檢測(cè)引物[20]。通過對(duì)春性小麥品種完整VRN1基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其顯性等位基因VRN1在第一內(nèi)含子區(qū)有4 kb的片段缺失，其中2.8 kb序列在隱性等位基因vrn1中具有高度保守性，并由此開發(fā)出春化基因VRN1的特異性檢測(cè)引物[21]。Yan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，春性小麥品種在Vrn-B3的啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入，并根據(jù)該插入缺失設(shè)計(jì)出小麥冬春性特異性檢測(cè)引物。基于前人研究結(jié)果，本研究利用冬春性小麥VRN1和Vrn-B3啟動(dòng)子區(qū)或內(nèi)含子區(qū)插入缺失設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)271份北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)小麥主栽品種進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果顯示，所檢測(cè)品種中均不含顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B3。

中國(guó)小麥地方品種中4個(gè)主效的春化基因分布頻率和分布地域差異較大。顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B1主要出現(xiàn)在東北和西北等春麥區(qū)；顯性等位基因Vrn-D1分布頻率呈現(xiàn)從南向北依次遞減趨勢(shì)；而顯性等位基因Vrn-B3在中國(guó)小麥品種中分布頻率極低[14，22]。姜瑩等[14]對(duì)中國(guó)小麥地方品種VRN1基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)小麥地方品種中顯性春化基因Vrn-D1分布頻率較高，達(dá)60.8%；而顯性等位基因Vrn-B3在所檢測(cè)的品種中分布頻率為0。李哲等[22]對(duì)中國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)品種春化基因進(jìn)行分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)顯性等位基因Vrn-D1分布頻率高達(dá)44.6%，明顯高于顯性等位基因Vrn-B1(18.1%)和Vrn-A1(11.2%)，顯性等位基因Vrn-B3分布頻率僅為0.8%。郭總總等[23]對(duì)黃淮麥區(qū)91份小麥材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)材料中不含顯性等位基因Vrn-A1和Vrn-B3，顯性等位基因Vrn-D1分布頻率為41.8%，明顯高于顯性等位基因Vrn-B1(6.6%)。游銀等[24]對(duì)黃淮麥區(qū)部分骨干親本的春化基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)材料中顯性春化基因Vrn-D1分布頻率為20.3%，顯性基因Vrn-B1分布頻率為4.7%，未檢測(cè)到顯性基因Vrn-A1和Vrn-B3的分布。本研究結(jié)果顯示，顯性等位基因Vrn-D1在271份供試小麥品種中分布頻率為27.7%，其次為Vrn-B1(3.0%)，Vrn-A1和Vrn-B3沒有分布，這可能是冬麥區(qū)小麥品種對(duì)春化作用的需求較強(qiáng)造成的。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，說明顯性春化基因Vrn-D1和Vrn-B1是控制北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)小麥冬春性的主要基因。

據(jù)報(bào)道，冬麥區(qū)是小麥春化基因的基因型推測(cè)表現(xiàn)型與實(shí)際表現(xiàn)型一致性較差的區(qū)域，因此，進(jìn)一步分析該麥區(qū)春化基因?qū)π←湺盒缘挠绊懹葹橹匾?。姜瑩等[14]研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)春麥區(qū)春化基因推測(cè)的冬春性與實(shí)際小麥的冬春性一致性較高，冬麥區(qū)的一致性較低。趙彥坤等[25]對(duì)黃淮麥區(qū)北片小麥材料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，春化基因鑒定的基因型與表現(xiàn)型一致性較低，主要與Vrn-D1的顯性變異有關(guān)。本研究檢測(cè)了4個(gè)春化基因位點(diǎn)(Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B3)在小麥品種的分布，春化基因組合vrn-A1/vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3和vrn-A1/Vrn-B1/vrn-D1/vrn-B3推測(cè)的表現(xiàn)型與冬春性的一致性較高，vrn-A1/vrn-B1/Vrn-D1/vrn-B3推測(cè)的表現(xiàn)型與冬春性一致性較低，其原因可能是由顯性春化基因Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1對(duì)低溫春化的敏感性和需求不同造成的[14]，顯性春化基因Vrn-B1對(duì)小麥春化發(fā)育特性的作用強(qiáng)于Vrn-D1、弱于Vrn-A1。由此可見，部分含有顯性等位基因Vrn-D1的材料需要春化才能開花結(jié)實(shí)，而包含顯性等位基因Vrn-B1的小麥材料對(duì)春化的需求明顯較弱。北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)小麥材料中可能存在其他控制春化作用的基因。