水稻芽期響應(yīng)鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

王燕寧，黃 濤，吳光亮，黃詩(shī)穎，鐘 奇，王 鵬，楊朦朦，李才敬，程 琴，賀浩華，2，金 偉，郭 凌，邊建民，2

(1.作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.江西省水稻高水平工程研究中心，江西 南昌 330045；3.南昌市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江西 南昌 330200)

水稻是我國(guó)的主要糧食作物之一，具有富集鎘的特性[1-2]。水稻根、莖、葉、籽粒容易富集鎘，嚴(yán)重影響水稻的光合作用、蒸騰作用和其他生理過程，而且會(huì)產(chǎn)生過量的氧自由基影響水稻的正常生長(zhǎng)發(fā)育[3]，鎘還會(huì)通過稻米進(jìn)入人體，危害人類健康[4-5]。近年來，水稻鎘危害引起人們廣泛關(guān)注，因此，了解水稻鎘脅迫的遺傳機(jī)制，培育耐鎘水稻品種對(duì)于降低水稻鎘危害、保障稻米安全具有重要作用。

水稻鎘脅迫相關(guān)性狀屬于復(fù)雜性狀，受到多個(gè)遺傳位點(diǎn)共同調(diào)控，近年來研究人員通過外源鎘處理的方法，定位了多個(gè)與根長(zhǎng)、株高、干質(zhì)量和鎘含量相關(guān)的QTLs，大多數(shù)效應(yīng)較小。Yan等[6]通過一個(gè)重組自交系群體(RILs)定位到與鎘含量相關(guān)的5個(gè)主效QTLs(scc10、gcc3、gcc9、gcc11和sgr5)，其中sgr5是一個(gè)新的潛在QTL，對(duì)鎘從地上部到籽粒的分布影響較大。Ishikawa等[7]利用Sasanishiki和Habataki構(gòu)建的回交自交系(BILs)定位群體在7號(hào)染色體上鑒定到一個(gè)新型主效QTLqGCd7，qGCd7是提高水稻籽粒鎘含量的特異性QTL。駱旭添[8]利用Lemont(美國(guó))和Dular(印度)雜交構(gòu)建的RILs，以葉綠素含量、根長(zhǎng)、株高、葉長(zhǎng)為指標(biāo)共檢測(cè)到16個(gè)加性QTL，涉及水稻第1，2，3，4，6，7，11號(hào)等7條染色體。Pan等[9]對(duì)生長(zhǎng)在不同程度鎘污染土壤上的338份不同稻種資源的鎘積累能力進(jìn)行了評(píng)估，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究發(fā)現(xiàn)了35個(gè)與鎘積累顯著相關(guān)的QTL。Li等[10]利用CH891和02428構(gòu)建的BILs定位了鎘脅迫下種子發(fā)芽率相關(guān)的6個(gè)加性QTL和16對(duì)上位性QTL。

鎘相關(guān)基因的克隆也取得了一定的進(jìn)展，在水稻12條染色體上均有分布。Ueno等[11]利用鎘高積累品種Anjana Dhan和日本晴構(gòu)建的定位群體，克隆了水稻低鎘積累基因OsHMA3，該基因主要影響鎘從地下向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)效率以及地上部的鎘積累，此后發(fā)現(xiàn)該基因在品種間存在多個(gè)自然變異類型。Luo等[12]利用鎘積累差異顯著的2個(gè)品種臺(tái)中1號(hào)和春江06，構(gòu)建雜交群體克隆到了一個(gè)特異性調(diào)控水稻葉片鎘積累的主效QTL—CAL1基因。該基因編碼植物防御素類似蛋白，定向調(diào)控鎘在葉片等營(yíng)養(yǎng)器官的積累。鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsZIP3能降低水稻根中的鎘含量[13]。Chen等[14]分離出一個(gè)水稻耐鎘突變體，并認(rèn)為OsCADT1是造成突變體耐鎘的基因。LCD是一個(gè)水稻低鎘基因，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，被認(rèn)為是低鎘水稻育種中的潛在可利用基因。鎘脅迫下，其功能缺失型突變體植株的籽粒鎘含量比野生型植株減少1/2[15]。OsCd1是Yan等[16]利用127份自然群體材料通過GWAS定位到的QTL中分離到的水稻籽粒鎘積累基因，OsCd1屬于MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能轉(zhuǎn)運(yùn)鎘離子，參與根系鎘吸收。

多年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)水稻鎘脅迫的遺傳機(jī)理進(jìn)行了許多研究，但主要集中在成熟期鎘的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，而水稻幼芽期對(duì)鎘脅迫較為敏感[17-18]，因此，如何降低鎘脅迫對(duì)水稻幼芽的危害也是目前抗逆育種急需解決的問題。研究還表明，不同水稻品種對(duì)鎘的吸收和積累能力存在明顯差異[19]，秈稻和粳稻在鎘脅迫下的抗逆性也有顯著差異，但是造成這種差異的機(jī)制還不清楚[20]。

本研究以秈稻品種CH891和粳稻品種02428為供試材料，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)2個(gè)品種在正常條件和鎘處理3 d后幼苗的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，旨在為闡明秈、粳稻響應(yīng)鎘脅迫的遺傳差異提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為鎘敏感的秈稻恢復(fù)系CH891與耐鎘的粳稻品種02428。

1.2 水稻種子鎘處理與樣品采集

挑選健康飽滿的谷粒用1%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，用蒸餾水沖洗3～4次。將消毒過的谷粒浸種24 h，25 ℃催芽1～2 d。分別選取CH891和02428大小、露白基本一致的30粒種子放置于鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中，處理組用濃度為200 mg/L的CdCl2溶液處理，對(duì)照組用相同體積的蒸餾水處理，處理組和對(duì)照組均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。處理組和對(duì)照組放入同一個(gè)光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。白天溫度設(shè)置為(27.0±0.5)℃，夜間溫度設(shè)置為(25 .0±0.5)℃，光期時(shí)長(zhǎng)設(shè)為14 h，暗期時(shí)長(zhǎng)設(shè)為10 h。第3天時(shí)將2個(gè)品種水稻鎘處理和正常條件下的幼苗分別取下，用錫箔紙包裹置于液氮中速凍，放置在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA提取

利用TRIzol試劑提取第3天鎘處理和對(duì)照組CH891和02428的RNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，利用2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA純度和濃度，RNA質(zhì)量合格后送去聯(lián)川生物公司。

1.4 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用mRNA片段作為模板構(gòu)建cDNA文庫(kù)，cDNA文庫(kù)構(gòu)建由聯(lián)川生物公司完成，最后在Illumina HiSeq 4000平臺(tái)上進(jìn)行雙末端測(cè)序[21]。

1.5 生物信息學(xué)分析

將原始讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)(Raw read)進(jìn)行過濾，將過濾掉低質(zhì)量reads的高質(zhì)量序列(Clean read)比對(duì)到參考基因組，對(duì)所有比對(duì)上的基因進(jìn)行表達(dá)水平分析，并用FPKM值表示各基因表達(dá)水平，再進(jìn)一步進(jìn)行基因表達(dá)水平差異研究和差異基因功能分析[22-23]。

1.6 差異基因表達(dá)分析

利用edgeR對(duì)StringTie組裝和定量完畢的基因進(jìn)行差異分析(顯著差異的閾值為|Log2Fold Change|≥1，P<0.05)。Fold Change是基因的變化倍數(shù)值，一般認(rèn)為數(shù)值在2以上的表示該基因的表達(dá)量在2個(gè)比較組之間存在顯著差異。P-value是各個(gè)基因差異表達(dá)概率，其數(shù)值一般控制在0.05水平內(nèi)，即<0.05表示在95%的置信區(qū)間內(nèi)該基因是差異表達(dá)基因(可過濾假陽性差異表達(dá)基因)。此外，通過繪制火山圖可以了解差異表達(dá)基因的整體分布情況，根據(jù)樣品基因表達(dá)譜的相近程度，將差異基因進(jìn)行聚類分析，直觀地展示基因在不同樣品(或是不同處理)中的表達(dá)情況，由此獲取生物學(xué)相關(guān)信息[24]。

1.7 差異表達(dá)基因功能注釋和分類富集分析

所有差異表達(dá)基因均在Gene Ontology(GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中分別進(jìn)行GO和KEGG注釋，網(wǎng)址分別為http：//www.geneontology.org/page/download-go-annotatios和www.genome.jp/kegg。利用WEGO和OMICSHARE進(jìn)一步對(duì)注釋得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分類富集分析，網(wǎng)址分別為http：//wego.genomics.org.cn和http：//www.omicshare.com/tools/index.php/。

1.8 qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果，通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR(qRT-PCR)證實(shí)了幾個(gè)基因的不同表達(dá)模式。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)本試驗(yàn)樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照cDNA 1 μL，Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，ddH2O 7 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上下引物10 μmol/L各0.8 μL的比例配置qRT-PCR反應(yīng)體系(表1)。反應(yīng)程序設(shè)定為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)基因設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)性重復(fù)。利用qRT-PCR所得Ct值計(jì)算樣品中基因的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)[25-26]。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The sequences for qRT-PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下CH891和02428的表型差異

正常情況下秈稻CH891幼芽顯著長(zhǎng)于粳稻02428，鎘處理后，CH891和02428的生長(zhǎng)均受到明顯抑制，其中CH891受到抑制的程度大于02428，芽長(zhǎng)顯著變短，但鎘處理3 d后CH891和02428的芽長(zhǎng)沒有顯著差異，表明CH891幼芽生長(zhǎng)對(duì)鎘的敏感性高于02428(圖1)。

2.2 樣品RNA質(zhì)量檢測(cè)與測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)和質(zhì)量評(píng)估

使用高通量 Illumina HiSeq 4000(CA，美國(guó))對(duì)CH891和02428在鎘處理3 d和正常生長(zhǎng)的幼芽進(jìn)行RNA-Seq，總共產(chǎn)生545 010 200個(gè)原始測(cè)序讀長(zhǎng)數(shù)(Raw read)，平均每個(gè)樣本產(chǎn)生45 417 517個(gè)原始測(cè)序讀長(zhǎng)數(shù)。過濾掉不合格序列后共得到539 524 490個(gè)有效讀長(zhǎng)(Valid read)，占原始讀長(zhǎng)的99.01%以上。所有樣品測(cè)序讀長(zhǎng)與參考基因組比對(duì)率為94.81%～96.82%，其中唯一比對(duì)率為62.11%～74.21%，所有樣品的GC含量均在49%以上，測(cè)序質(zhì)量較好，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)分析(表2)。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和參考基因組上的比對(duì)率Tab.2 Sequencing data statistics and mapped ratios to the reference genome

2.3 差異表達(dá)基因數(shù)量分析

各比較組中差異表達(dá)基因數(shù)目如圖2所示。對(duì)照條件下，CH891與02428(CK3_CH891 vs.CK3_02428)之間存在4 911個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因1 647個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因3 264個(gè)；鎘處理?xiàng)l件下，CH891與02428(Cd3_ CH891 vs.Cd3_02428)之間存在2 542個(gè)差異表達(dá)基因，其中有1 499個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，1 043個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；CH891鎘處理后與對(duì)照相比(Cd3_CH891 vs.CK3_CH891)共存在1 952個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因1 203個(gè)，下調(diào)表達(dá)749個(gè)基因；02428鎘處理后與對(duì)照相比(Cd3_02428 vs.CK3_02428)共有1 792個(gè)差異表達(dá)基因，其中有516個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，1 276個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。

A、B、C和D.火山分布圖；E.上下調(diào)差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)。A，B，C and D.Volcano plot；E.The number of up and down-regulated DEGs.

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，以O(shè)sActin作為內(nèi)參基因，隨機(jī)挑選了12個(gè)差異表達(dá)基因(LOC_Os03g08470、LOC_Os04g39880、LOC_Os09g36700、LOC_Os10g40720、LOC_Os02g02400、LOC_Os04g3830、LOC_Os06g21590、LOC_Os09g31430、LOC_Os01g18744、LOC_Os06g13280、LOC_Os03g03600、LOC_Os08g06110)，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR分析，將qRT-PCR結(jié)果與差異表達(dá)基因的Log2(Fold Change)值進(jìn)行比較，結(jié)果表明，qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq趨勢(shì)一致(圖3)，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖3 差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄組與qRT-PCR比較Fig.3 Comparison of differentially expressed gene transcriptome and qRT-PCR results

2.5 差異表達(dá)基因分類

通過對(duì)同一水稻品種在不同環(huán)境和不同水稻品種在相同環(huán)境的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較，共獲得4個(gè)比較組，分別為Cd3_CH891 vs.Cd3_02428、CK3_CH891 vs.CK3_02428、Cd3_CH891 vs.CK3_CH891和Cd3_02428 vs.CK3_02428。在4個(gè)比較組中共存在7 204個(gè)差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因可以分為15個(gè)亞組(圖4)。去掉CK3_CH891 vs.CK3_02428與鎘無關(guān)的基因，剩余的7個(gè)亞組可以分為3個(gè)類別：CH891特異表達(dá)的基因(SCR3)、02428特異表達(dá)的基因(RCR3)、2個(gè)品種均有表達(dá)但表達(dá)量存在差異的基因(CCR3)。其中，SCR3有849個(gè)，RCR3有676個(gè)，CCR3有770個(gè)(表3)。

圖4 4個(gè)比較組差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig.4 Venn diagrams for DEGs in the four comparison groups

以|log2(Fold change)| ≥2并且至少在一個(gè)比較組的一組數(shù)據(jù)中FPKM≥2為篩選條件，分別對(duì)3個(gè)類別的基因進(jìn)行篩選，共獲得554個(gè)主效的鎘相關(guān)基因，其中194個(gè)來自SCR3，154個(gè)來自RCR3，206個(gè)來自CCR3。

表3 差異表達(dá)基因的分類Tab.3 Classification of three categories of DEGs

2.6 基因功能注釋

2.6.1 SCR3基因功能注釋 GO富集分析顯示，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA模板、細(xì)胞核、膜的整體結(jié)構(gòu)、質(zhì)膜相關(guān)的基因、RNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活性和序列特異性DNA結(jié)合、金屬離子結(jié)合相關(guān)的基因在SCR3中均有富集(圖5)。KEGG富集分析中，異黃酮生物合成、磷酸肌醇代謝、黃酮類生物合成和花青素生物合成等途徑在SCR3中富集，其中異黃酮生物合成和花青素生物合成途徑顯著富集(圖6)。

1.生物進(jìn)程；2.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA模板；3.轉(zhuǎn)錄、DNA模板；4.蛋白磷酸化；5.代謝過程；6.傷害反應(yīng)；7.氧化還原反應(yīng)；8.脫落酸反應(yīng)；9.油菜素類固醇反應(yīng)；10.脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；11.缺氧反應(yīng)；12.蛋白質(zhì)泛素化；13.蛋白酶體介導(dǎo)的泛素化依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程；14.冷反應(yīng)；15.多細(xì)胞生物發(fā)育；16.種子休眠中組織胚胎發(fā)育；17.葉發(fā)育；18.光刺激反應(yīng)；19.蛋白質(zhì)折疊；20.類黃酮葡萄糖醛酸化；21.胞外分泌；22.次級(jí)代謝生物合成；23.防御反應(yīng)；24.赤霉素反應(yīng)；25.甲基化作用；26.核；27.膜整體結(jié)構(gòu)；28.質(zhì)膜；29.細(xì)胞質(zhì)；30.細(xì)胞外區(qū)域；31.胞液；32.葉綠體；33.膜；34.高爾基體；35.線粒體；36.細(xì)胞壁；37.植物細(xì)胞壁；38.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；39.質(zhì)膜固定組成成分；40.胞間連絲；41.分子功能；42.RNA結(jié)合；43.轉(zhuǎn)錄活性、序列特異性DNA結(jié)合；44.金屬離子結(jié)合；45.蛋白結(jié)合；46.ATP結(jié)合；47.羧基酯水解酶；48.蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性；49.鋅離子結(jié)合；50.水解酶活性。

1.α亞麻酸代謝；2.萜類骨架生物合成；3.類固醇生物合成；4.淀粉和蔗糖代謝；5.倍半萜和三萜類生物合成；6.自噬調(diào)節(jié)；7.RNA聚合酶；8.RNA降解；9.嘧啶代謝；10.卟啉和葉綠素代謝；11.植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；12.光合作用；13.磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)；14.類苯丙酸生物合成；15.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；16.磷酸戊糖途徑；17.N-聚糖生物合成；18.異黃酮生物合成；19.磷酸肌醇代謝；20.糖基磷脂酰肌醇生物合成；21.硫代葡萄糖苷生物合成；22.類黃酮生物合成；23.醚類脂代謝；24.二帖生物合成；25.角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成；26.類胡蘿卜素；27.光合生物的碳固定；28.生物合成；29.堿基切除；30.花青素生物合成。

2.6.2 RCR3基因功能注釋 GO富集分析顯示，轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA模板、細(xì)胞核、質(zhì)膜、膜整體結(jié)構(gòu)、和胞外區(qū)域相關(guān)的基因、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān)的基因在RCR3都有富集(圖7)。KEGG富集分析顯示，核糖體、自噬調(diào)節(jié)和胰島素抗性等途徑在RCR3中富集，其中核糖體和自噬調(diào)節(jié)富集程度最為顯著(圖8)。

2.6.3 CCR3基因功能注釋 GO富集分析顯示，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA模板、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、膜整體結(jié)構(gòu)、質(zhì)膜相關(guān)的基因、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性的DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、鋅離子結(jié)合相關(guān)的基因在CCR3中富集(圖9)。KEGG富集分析顯示，α-亞麻酸代謝、吞噬體、過氧化物酶體、檸檬烯和蒎烯的降解以及脂肪酸降解途徑在CCR3中富集，其中α-亞麻酸代謝和脂肪酸降解途徑極顯著富集(圖10)。

1.生物過程；2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板；3.轉(zhuǎn)錄、DNA模板；4.氧化還原反應(yīng)；5.防御反應(yīng)；6.蛋白磷酸化；7.細(xì)胞壁組織；8.脫落酸反應(yīng)；9.傷害反應(yīng)；10.鹽脅迫反應(yīng)；11.蛋白質(zhì)水解；12.多細(xì)胞生物發(fā)育；13.一維細(xì)胞生長(zhǎng)；14.氧化應(yīng)激反應(yīng)；15.冷反應(yīng)；16.獨(dú)腳金內(nèi)酯生物合成；17.茉莉酸反應(yīng)；18.蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程；19.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；20.脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；21.類黃酮生物合成過程；22.卡里金反應(yīng)；23.涉及多維細(xì)胞生長(zhǎng)的植物型細(xì)胞壁修飾；24.蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體；25.胞吐作用中的囊泡對(duì)接；26.核；27.質(zhì)膜；28.膜整體結(jié)構(gòu)；29.胞外區(qū)域；30.細(xì)胞質(zhì)；31.線粒體；32.膜；33.葉綠體；34.細(xì)胞溶質(zhì)；35.胞間連絲；36.細(xì)胞壁；37.細(xì)胞組分；38.液泡；39.植物細(xì)胞壁；40.細(xì)胞內(nèi)有膜的細(xì)胞器；41.分子功能；42.轉(zhuǎn)錄活性、序列特異性DNA結(jié)合；43.蛋白結(jié)合；44.DNA結(jié)合；45.蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性；46.ATP結(jié)合；47.金屬離子結(jié)合；48.激酶活性；49.核糖體的結(jié)構(gòu)成分；50.鋅離子結(jié)合。

1.mRNA監(jiān)控途徑；2.β-丙氨酸代謝；3.玉米素生物合成；4.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；5.囊泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用；6.核糖體；7.自噬調(diào)節(jié)；8.丙酸代謝；9.植物-病原體相互作用；10.植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；11.苯丙酸類生物合成；12.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；13.磷酸戊糖；14.氧化磷酸化；15.其他類型O-聚糖生物合成；16.其他聚糖降解；17.N聚糖生物合成；18.胰島素抗性；19.糖苷磷酸肌醇生物合成；20.醣酵解/糖異生；21.果糖和甘露糖；22.二帖生物合成；23.角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成；24.TCA循環(huán)；25.類胡蘿卜素生物合成；26.碳代謝；27.堿基切除修復(fù)；28.抗壞血酸鹽和醛酸鹽；29.精氨酸和脯氨酸代謝；30.花青素生物合成。

1.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA模板；2.生物進(jìn)程；3.轉(zhuǎn)錄、DNA模板；4.傷害反應(yīng)；5.蛋白質(zhì)泛素化；6.氧化還原反應(yīng)；7.冷反應(yīng)；8.脫落酸反應(yīng)；9.水楊酸反應(yīng)；10.寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)；11.防御反應(yīng)；12.氧化應(yīng)激反應(yīng)；13.脂肪酸生物合成；14.脫水反應(yīng)；15.參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝過程的蛋白質(zhì)水解；16.光刺激反應(yīng)；17.一維細(xì)胞生長(zhǎng)；18.乙炔激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；19.赤霉酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；20.次級(jí)代謝生物合成；21.鹽脅迫反應(yīng)；22.幾丁質(zhì)反應(yīng)；23.調(diào)控防御反應(yīng)；24.其他有機(jī)物反應(yīng)；25.木質(zhì)素生物合成；26.核；27.細(xì)胞質(zhì)；28.膜整體結(jié)構(gòu)；29.質(zhì)膜；30.膜；31.葉綠體；32.細(xì)胞內(nèi)；33.胞外區(qū)域；34.線粒體；35.質(zhì)膜固定成分；36.細(xì)胞溶質(zhì)；37.高爾基體；38.質(zhì)體；39.葉綠體基質(zhì)；40.細(xì)胞壁；41.轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合；42.分子功能；43.蛋白質(zhì)結(jié)合；44.DNA結(jié)合；45.鋅離子結(jié)合；46.序列特異性DNA結(jié)合；47.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性；48.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移糖?；?；49.蛋白泛素化轉(zhuǎn)移酶活性；50.轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合。

1.α亞麻酸代謝；2.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解；3.銻烯類、二芳基庚烷類和姜酚生物合成；4.植物病原體互作；5.吞噬體；6.過氧化物酶體；7.煙酸鹽和煙酰胺代謝；8.N聚糖生物合成；9.賴氨酸降解；10.亞油酸代謝；11.檸檬烯和蒎烯降解；12.異黃酮類生物合成；13.糖磷脂生物合成；14.糖磷脂生物合成-神經(jīng)節(jié)系列；15.糖酵解/糖異生；16.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；17.甘油磷脂代謝；18.半乳糖代謝；19.脂肪酸延伸；20.脂肪酸降解；21.脂肪酸生物合成；22.二帖生物合成；23.角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成；24.TCA循環(huán)；25.植物晝夜節(jié)律；26.碳代謝；27.油菜素類固醇生物合成；28.精氨酸生物合成；29.氨?；鵷RNA生物合成；30.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。

3 結(jié)論與討論

鎘作為一種重金屬污染物，嚴(yán)重影響水稻的正常生長(zhǎng)發(fā)育。水稻鎘抗性機(jī)制十分復(fù)雜，因品種、遺傳背景不同而存在差異。本研究通過對(duì)耐鎘粳稻品種02428和鎘敏感秈稻品種CH891進(jìn)行鎘處理，并對(duì)第3天的幼苗進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。結(jié)果表明，CH891和02428的代謝途徑在鎘處理3 a后存在差異，表明代謝途徑的差異可能是秈稻和粳稻對(duì)鎘脅迫反應(yīng)不同的原因。因此，深入分析這些代謝途徑中差異表達(dá)的基因?qū)τ诮忉尪i稻和粳稻鎘脅迫差異是必要的。

3.1 SCR3中的差異表達(dá)基因

差異表達(dá)基因的代謝途徑富集分析表明，異黃酮生物合成和花青素生物合成途徑是SCR3的主要富集通路。有研究表明，異黃酮在植物防御反應(yīng)中起到重要作用[27]。在鎘脅迫下，植物中的細(xì)胞壁受到破壞，使其易受到病原體的侵害，從而誘導(dǎo)了異黃酮的表達(dá)以抵抗病害[28]。本研究結(jié)果可能為水稻在異黃酮水平上對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)提供新的見解。花青素是一種抗氧化劑，能清除植物細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，減輕活性氧的毒性[29]。Roychoudhury等[30]發(fā)現(xiàn)，花青素生物合成能被CdCl2誘導(dǎo)，與本研究結(jié)果相一致，表明花青素作為一種抗氧化劑，與水稻鎘脅迫反應(yīng)相關(guān)，可能減輕鎘對(duì)水稻的毒害作用。

3.2 RCR3中的差異表達(dá)基因

就RCR3而言，不同水稻品種的KEGG代謝通路在鎘脅迫后也存在不同。Bai等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與核糖體相關(guān)的DEGs在冷應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。核糖體途徑在本研究中富集于RCR3中，表明核糖體途徑很可能在水稻鎘脅迫下被誘導(dǎo)并發(fā)揮作用。自噬可以將應(yīng)激引起的氧化蛋白和損傷的胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)娇张葜薪到?，從而減少毒性物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的積累[32]，它在植物的發(fā)育和對(duì)脅迫的響應(yīng)中起著重要的作用[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，RCR3中誘導(dǎo)了自噬途徑的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步驗(yàn)證了自噬調(diào)節(jié)在水稻鎘脅迫中發(fā)揮了一定的作用。這2條通路是本研究在水稻鎘脅迫下發(fā)現(xiàn)的未被大量報(bào)道的途徑。

3.3 CCR3中的差異表達(dá)基因

代謝途徑差異同樣存在于CCR3中。α-亞麻酸代謝和脂肪酸降解可概括為脂肪酸代謝，它與CCR3中的鎘反應(yīng)有關(guān)。已有研究表明，重金屬能特異性地改變植物體內(nèi)脂肪酸代謝，鎘能提高脂質(zhì)過氧化物水平，導(dǎo)致水稻體內(nèi)脂肪酸含量發(fā)生強(qiáng)烈變化[34-35]。本研究中，α-亞麻酸代謝和脂肪酸降解途徑在CCR3中顯著富集，進(jìn)一步證明脂肪酸代謝可能是水稻對(duì)鎘脅迫的應(yīng)激反應(yīng)之一。

綜上所述，本研究表明，水稻鎘響應(yīng)機(jī)制存在品種的特異性。SCR3中富集的信號(hào)通路大多與次級(jí)代謝過程相關(guān)，而RCR3中則多為蛋白質(zhì)代謝。這表明CH891可能通過誘導(dǎo)次生代謝過程對(duì)鎘產(chǎn)生應(yīng)答，從而增強(qiáng)其免疫力和逆境抗性。而02428中蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和降解過程受到影響，從而保護(hù)自身不受鎘的侵害。