舟山海島地區(qū)蜱媒病原體多樣性及其基因同源性分析

李科峰 梁思慧 戴亞欣 劉潔楠 仝振東

舟山市疾病預(yù)防控制中心傳防科，舟山 316021

蜱屬體外寄生生物，寄生于兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)和哺乳類(lèi)等動(dòng)物，部分種類(lèi)可侵襲人類(lèi)，傳播多種病原體。研究表明，蜱的整個(gè)生命周期均可攜帶病原體[1-2]，其造成的危害僅次于蚊類(lèi)[3-4]。據(jù)報(bào)道，全球以發(fā)熱伴血小板減少綜合征為代表的蜱媒傳染病(TBD)發(fā)病率不斷上升[5-6]。舟山市蜱密度高，有學(xué)者在岱山采集到的長(zhǎng)角血蜱中檢測(cè)出無(wú)形體和一種新的埃立克體病原體[7]。本研究采集舟山各縣區(qū)環(huán)境中的游高蜱或者動(dòng)物身上的寄生蜱，開(kāi)展TBD病原體的檢測(cè)，了解其分布，為舟山市TBD防控提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、蜱樣本的采集與分類(lèi)

2020年4—11月采集舟山各縣區(qū)不明原因發(fā)熱伴血小板減少征病例居住環(huán)境中的游離蜱及家畜身上的寄生蜱。選用布旗法，采集野外草地上的游離未吸血蜱；選用畜體檢查法，采集家畜身上的寄生蜱，于實(shí)驗(yàn)室解剖顯微鏡下進(jìn)行分類(lèi)。

二、試劑與儀器

一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒（RR064A）、一步法RT-PCR試劑盒（RR055A）、PCR試劑盒（RR902A）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，新布尼亞病毒、腹地病毒、流行性出血熱病毒（漢城型）、流行性出血熱病毒（漢灘型）、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的引物、探針、測(cè)序用引物以及陽(yáng)性重組質(zhì)粒委托寶生物工程（大連）有限公司合成與構(gòu)建。嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體與查菲埃立克體巢式PCR引物委托第三方生物技術(shù)公司合成。

主要儀器有Ⅱ級(jí)生物安全柜（美國(guó)LABCONCO公司）、ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）、普通PCR儀（美國(guó)ABI公司）、成像儀（美國(guó)ABI公司）、LEGEND MICRO冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）、MM400混合球磨儀（德國(guó)Retsch公司）。

三、核酸制備

將采集的蜱樣本根據(jù)體型大小選取3～6只為1組，放入2 mL EP管中，用25%酒精消毒蜱體表1 min后，去除上清液。加入1 mL 2-甲氧基乙氧基甲基氯（MEM）渦旋清洗，8 000轉(zhuǎn)/min離心（離心半徑8.4 cm），5 min去除上清液，反復(fù)3次。加入500 μL MEM后，于低溫下在MM400混合球磨儀中以50 Hz研磨2 min，反復(fù)2次。8 000轉(zhuǎn)/min低溫離心5 min后（離心半徑8.4 cm），取上清液200 μL提取RNA進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)。余下300 μL上清液，其中200 μL用于復(fù)核，100 μL用于病毒分離。

四、核酸檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTS）RNA參照《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南（2010版）》[8]檢測(cè)方案，熒光RT-PCR引物探針序列參考中國(guó)CDC提供的序列[9]；巢式PCR檢測(cè)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體DNA參照中華人共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-國(guó)境口岸蜱類(lèi)攜帶嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的PCR檢測(cè)方法（SN/T 4009-2014）；巢式PCR檢測(cè)查菲埃立克體DNA參照湖北省CDC張令要等[10]報(bào)道方法，運(yùn)用PCR對(duì)采集的蜱樣本進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16S rRNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析。蜱樣本中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體與立克次體通用引物PCR電泳陽(yáng)性條帶者再用特異引物進(jìn)行電泳。熒光RT-PCR引物探針和巢式PCR引物詳見(jiàn)表1和表2。

表1 五種病原體實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物探針序列

表2 嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體與相關(guān)體巢式PCR外套引物序列

結(jié) 果

一、蜱樣本采集及檢測(cè)情況

共采集蜱樣本99只，其中游離蜱樣本39只，寄生蜱樣本60只。根據(jù)是否游離蜱進(jìn)行分組，分為20組，每組3～6只蜱蟲(chóng)，1～7組為游離蜱（共7組），8～20組為寄生蜱（共13組）。

本研究未檢出查菲埃立克體、新型布尼亞病毒、漢坦與漢城病毒。在7組游離蜱樣本和13組寄生蜱樣本中，分別有3組和1組檢測(cè)出嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體。此外，在游離蜱樣本中，分別有2組和1組檢測(cè)出立克次體和沃爾巴克體；在寄生蜱樣本中檢測(cè)出1組山羊無(wú)形體。其余組別的病原體檢出均陰性。蜱蟲(chóng)樣本PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 舟山海島地區(qū)蜱樣本中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體與立克次體通用引物PCR電泳圖

圖2 舟山海島地區(qū)蜱樣本中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體與立克次體特異引物PCR電泳圖

二、序列分析結(jié)果

巢式PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)16S rRNA[11]基因測(cè)序顯示，2號(hào)組樣本為沃爾巴克體，與日本報(bào)道的沃爾巴克體（AB025965）同源性為98.70%，與無(wú)形體16S rRNA基因序列相似度為88.50%～88.70%。3和6號(hào)組樣本為立克次體，與中國(guó)云南立克次體03（KY433580）、日本立克次體LA16[12]同源性為99.83%，與無(wú)形體16S rRNA基因序列相似度達(dá)82.60%～83.90%。4、5、7、18號(hào)組為嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體（同源性為97.74%～99.75%），在基因進(jìn)化中可分為2個(gè)分支，5和18號(hào)組為一個(gè)進(jìn)化分支與安徽桐城（MK045683）及韓國(guó)濟(jì)州島（GU064903）的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體同源性為100%；4和7號(hào)組與安徽金寨的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體 （MK045694）同源性為99.70%。詳見(jiàn)圖3和4。

圖3 舟山海島地區(qū)無(wú)形體、立克次體與沃爾巴克16SrRNA基因進(jìn)化樹(shù)

圖4 舟山海島地區(qū)無(wú)形體16S rRNA基因進(jìn)化樹(shù)

討 論

自2011年舟山市首次報(bào)告發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例以來(lái)，疫情逐年上升，一度成為浙江省發(fā)熱伴血小板減少綜合征發(fā)病率最高的地區(qū)[13]。在監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，每年均有部分有蜱叮咬史的病例檢測(cè)新型布尼亞病毒呈陰性，分析原因可能攜帶其他病原體。在本次研究中，我們首次在舟山海島地區(qū)蜱發(fā)現(xiàn)攜帶日本立克次體、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體、山羊無(wú)形體、沃爾巴克體等病原體，提示舟山居民有多種TBD病原體的暴露風(fēng)險(xiǎn)，為當(dāng)?shù)豑BD的防控提供科學(xué)依據(jù)，為其他地區(qū)相關(guān)研究提供參考。

無(wú)形體感染會(huì)引起無(wú)形體病，該病是一種以發(fā)熱伴白細(xì)胞血小板減少和多臟器功能損害為主要臨床表現(xiàn)的人畜共患自然疫源性疾病[14-15]。立克次體屬分斑點(diǎn)熱群和斑疹傷寒群，是一類(lèi)能引起人感染而引發(fā)斑點(diǎn)熱的細(xì)菌，其中日本立克次體可引起日本斑點(diǎn)熱。浙江省學(xué)者曾在杭州臨安區(qū)的病例中分離到日本立克次體[12]。本文作者在舟山捕獲的游離蜱樣本中檢測(cè)出嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體、日本立克次體和沃爾巴通體3種病原體，在寄生蜱中檢出山羊無(wú)形體和嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體2種病原體，其中立克次體與中國(guó)云南立克次體03（KY433580）、日本立克次體LA16[12]同源性為99.83%；檢出的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體其中一個(gè)進(jìn)化分支與安徽桐城（MK045683）及韓國(guó)濟(jì)州島（GU064903）的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體同源性達(dá)100.00%，主要為游離蜱；另外一支與安徽金寨的嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體（MK045694）同源性為99.70%，包括游離蜱和寄生蜱。以上結(jié)果提示舟山市是嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體、山羊無(wú)形體和日本立克次體的自然疫源地，暴露居民存在感染風(fēng)險(xiǎn)。雖然本研究在捕獲的蜱蟲(chóng)中未檢出新型布尼亞病毒核酸，但舟山市是發(fā)熱伴血小板減少綜合征的疫區(qū)，仍需要高度重視。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明李科峰：課題設(shè)計(jì)、研究、論文撰寫(xiě)；梁思慧、戴亞欣：數(shù)據(jù)分析、論文修改；劉潔楠、仝振東：蜱蟲(chóng)捕獲、檢測(cè)