月季黑斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

陳雪莉

（青島市市級公園管理服務(wù)中心青島市海泊河公園，山東 青島 266000）

從已掌握的月季病蟲害種類的危害性角度來看，黑斑病對月季健康情況影響最嚴(yán)重，并且發(fā)病率很高，在我國多地月季種植區(qū)域均有出現(xiàn)[1-2]。2021年在青島市海泊河公園的月季綠化帶中發(fā)現(xiàn)多株月季患有黑斑病。為此，文章以該地區(qū)的患病月季植株為試驗(yàn)對象，以分離純化的方式從形態(tài)與分子方面對黑斑病病原菌種類與生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定分析，以期為相關(guān)防控單位或科研人員提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

患病植株選取。以青島市海泊河公園月季綠化帶下患黑斑病月季植株（整株）為研究材料，在試驗(yàn)內(nèi)截取患病葉片作為分離與對照材料。

試劑和培養(yǎng)基。測定試劑采用賽默飛公司的DL DNA Marker、博奧龍2×Taq PCR Mixture（含上樣染料）、Loading buffer，引物見表1 所示。

表1 試驗(yàn)合成引物序列

試驗(yàn)使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，配制方法如下。選取干凈且水煮后的馬鈴薯200 g（濾液）、葡萄糖與瓊脂各20 g，將瓊脂與馬鈴薯濾液充分?jǐn)嚢瑁傊耆莘e后向其中加入稱取好的葡萄糖，將冷卻后的蒸餾水（1 L）加入其中并將培養(yǎng)液的pH 值調(diào)節(jié)為7.0，最后將培育液包好放于滅菌鍋中滅菌，滅菌完成后取出冷卻備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

月季葉片與黑斑病菌絲采用單孢分離法分離。首先，挑選整株月季患病植株中具有明顯黑斑病的患病葉片送至實(shí)驗(yàn)室，在黑斑病斑點(diǎn)與葉片的交界處選取9 mm×9 mm 的組織塊，將其浸泡在濃度為75%的乙醇溶液中消毒，浸泡30 s 后取出，用無菌水漂洗，共漂洗3 次。其次，將其浸泡在濃度為2%的次氯酸鈉溶液中，浸泡時(shí)間為60 s，浸泡完成后再次用無菌水浸洗，共浸洗3 次。再次，將其放置在滅菌濾紙上轉(zhuǎn)移至無菌室晾干，晾干后將其移放至環(huán)境溫度為28 ℃恒溫環(huán)境下的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。采用第三次清洗液制作涂布平板并將其作為陰性對照，培養(yǎng)4～5 d 后觀察黑斑病菌菌落生長狀況，取菌絲尖端孢子放置于新的PDA 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)環(huán)境為28 ℃），不斷重復(fù)上述操作直到分離出純化菌株。

1.2.2 黑斑病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

初步觀察純化菌株培養(yǎng)基下的菌落疏密程度和顏色等菌落特征，將其放置在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，重點(diǎn)觀察對黑斑病病原菌菌絲和分生孢子的特征，例如分生孢子的形狀、大小、殘缺程度、孢子梗以及孢子有無隔膜等信息。

1.2.3 黑斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

使用CTAB 法對月季黑斑病病原菌的DNA 進(jìn)行提取，實(shí)際操作步驟如下。首先，需要在試驗(yàn)開始前將2-丙醇（C3H8O）放置在-20 ℃環(huán)境下預(yù)冷，將濃度為70%的乙醇放置在4 ℃環(huán)境下進(jìn)行恒溫處理，將試驗(yàn)使用的水浴鍋加熱至57 ℃。用無菌槍頭刮取0.1 mL的純化黑斑病菌絲，并將其置于2 mL 的離心管中，將石英砂（20μL）和2%的CTAB 提取緩沖液（300 μL）加入裝有黑斑病菌絲的離心管中，使用研磨棒對其進(jìn)行研磨直到所有物體研磨充分為止。向離心管中在此加入2%的CTAB 提取緩沖液（200 μL）并充分震蕩，將其放置在57 ℃的水浴鍋中恒溫加熱1 h 后使其自然冷卻至室溫，期間要注意每隔10 min 對離心管進(jìn)行1 次顛倒混勻。其次，當(dāng)水浴操作結(jié)束之后，需將等體積的500 μL 三氯甲烷（CHCl3）和C3H8O（比例為24∶1）溶液加入離心管中，將其放置在離心機(jī)中以10 000 r/min的速度離心10 min，在離心操作期間需要將濃度為10%的CTAB 提取緩沖液放置在65 ℃環(huán)境的水浴中加熱。取離心后上清液（300 μL）放置在新的離心管中，并將已加熱完成濃度為10%的CTAB 提取緩沖液（30 μL）加入新離心管中，振蕩混勻，之后再向其中加入比例為24∶1 的CHCl3與C3H8O的混合液（330 mL）。再次，將新的離心管放置在10 000 r/min 離心機(jī)中離心10 min。取離心后溶液的上清液（250 μL）放置在新的離心管，并向其中加入預(yù)冷好的C3H8O（250 μL）輕輕混勻，將其放置在-20 ℃環(huán)境下靜置30～60 min，將靜置完成的溶液再次放置在參數(shù)為12 000 r/min、溫度為4 ℃的離心機(jī)中離心10 min。最后，將離心完畢的溶液上清液緩慢剔除并倒置片刻，向離心管中加入提前預(yù)冷濃度為70%的乙醇洗滌（1 mL），放置在10 000 r/min的離心機(jī)中震蕩離心5 min。離心完成后除去上清液取剩余液體將其放置在工作臺上自然風(fēng)干。制作PCR 反應(yīng)體系（50 μL），其中主要成分包括3 μL 模板、1 μL上游引物、1 μL 下游引物，25 μL 博奧龍2×Taq PCR Mixture（含上樣染料）以及20 μL 去離子水。

PCR 反應(yīng)程序參數(shù)設(shè)定：預(yù)變性環(huán)境溫度為94 ℃、時(shí)間為3 min；變性溫度為94 ℃、時(shí)間為30 s；退火溫度為55 ℃、時(shí)間為45 s，35 個循環(huán)；延伸溫度為72 ℃、時(shí)間為10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至某生物工程研究所進(jìn)行比對測序，使用BLAST 將得到的序列與DNA序列數(shù)據(jù)庫GenBank 上對其同源性進(jìn)行比對，并將與月季黑斑病病原菌有關(guān)的同源序列下載到本地，以EF1-α、rDNA ITS 和GPD 序列為對象，以MEGA 進(jìn)化樹V7.0.26 軟件為基礎(chǔ)，借助鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[3-5]，如圖1 所示。

圖1 EF1-α、rDNA ITS 和GPD 聯(lián)合對比所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

1.2.4 致病性測定

對月季黑斑病的病原菌致病性測定將采用離體接種法進(jìn)行驗(yàn)證。首先，在接種前需要用無菌水沖洗健康的月季葉片，去除葉片表面的雜質(zhì)，然后使用滅菌接種針對葉片進(jìn)行破壞處理。其次，把放置在28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)的病原菌通過打孔器制成半徑為2.5 mm 的菌餅，并將其接種到健康月季葉片的接種點(diǎn)處，使用無菌PDA 培養(yǎng)基作為對照。再次，把接種后的對照葉片放在鋪有濕潤脫脂棉的培養(yǎng)皿中，維持培養(yǎng)環(huán)境溫度處于24～25 ℃，保濕培養(yǎng)3～5 d，以12 d 為周期觀察其發(fā)病狀況。

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性的測定

從溫度、pH 值以及光照等角度對月季黑斑病病原菌菌絲生長進(jìn)行試驗(yàn)，以平板測定法作為試驗(yàn)驗(yàn)證方法。將半徑為2.5 mm 的病菌菌餅接種到PDA 培養(yǎng)基的中央處，設(shè)計(jì)6 組培養(yǎng)溫度，分別為5 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和50 ℃；將半徑為2.5 mm 的黑斑病菌餅接種到pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0的PDA 培養(yǎng)基中央處；將其分別置于全光照、光暗交替（交替時(shí)間為12 h）以及全黑暗等環(huán)境下，并將半徑為2.5 mm 的黑斑病菌餅接種在PDA 培養(yǎng)基的中央處。將上述處理完畢的培養(yǎng)基放進(jìn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并定期測量其菌落半徑，所有處理重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過IBMSPSS Statistics v 27.0.0.1 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，運(yùn)用鄧肯氏多重比較法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析[6]。

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)病癥狀

月季葉片是出現(xiàn)黑斑病的主要部位。在黑斑病的發(fā)病初期，月季葉片正面會出現(xiàn)一處或多處褐色小斑點(diǎn)，隨著時(shí)間變化，這些小斑點(diǎn)會逐漸擴(kuò)大為近圓形的黑色斑點(diǎn)。在黑斑病的發(fā)病后期，月季葉片上黑斑病斑點(diǎn)會產(chǎn)生一些黑色顆粒，主要呈現(xiàn)零散或者輪狀排列，只有少部分種類的黑斑病斑點(diǎn)間相互連接。同時(shí)，黑斑病后期還會導(dǎo)致月季葉柄上產(chǎn)生一些暗褐色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)略凸起，但斑點(diǎn)邊緣并無明顯黑斑病菌絲。此時(shí)若不對其進(jìn)行治療，會造成月季葉片全部脫落或全部枯黃，嚴(yán)重時(shí)會間接導(dǎo)致月季植株死亡。

2.2 形態(tài)特征

從患有月季黑斑病的葉片病斑中獲得1 株黑斑病病原菌菌株，將其命名為A1。A1 在PDA 平板上生長2 d 后能夠明顯看出平板上出現(xiàn)零星的白色菌絲，繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后，病原植株開始產(chǎn)生孢子，7 d 后黑斑病植株可以長滿整個平板，此時(shí)觀察黑斑病菌落表面可以發(fā)現(xiàn)，其菌落表面濕潤但不光滑，整體呈黑褐色，孢子沒有出現(xiàn)輪紋，如圖2、圖3 所示。通過光學(xué)顯微鏡可以看出，黑斑病病原菌的分生孢子梗呈現(xiàn)灰褐色且有隔膜。病菌孢子為棒狀和長卵形，每個孢子均具有4～9 個橫隔膜和2～5 個縱隔膜，最大分生孢子的長寬為18.5 μm×24.7 μm，最小分生孢子的長寬為3.6 μm×7.1 μm，如圖4 所示，初步斷定青島市海泊河公園月季感染的是鏈格孢類黑斑病。

圖2 培養(yǎng)2 d（正面）

圖3 培養(yǎng)7 d（背面）

圖4 光顯微鏡下病菌孢子形態(tài)

2.3 致病性鑒定

記錄以致病性測定設(shè)計(jì)試驗(yàn)下觀察黑斑病菌株的發(fā)病時(shí)間與性狀。在新鮮葉片植入黑斑病菌餅后的3～5 d，其接種葉片上可以明顯看出存在黑褐色病斑，且人工移植的葉片上出現(xiàn)的病理癥狀與田間月季黑斑病癥狀十分相似，因此可認(rèn)為其發(fā)病率能夠達(dá)到98%，而只在葉片中接入PDA 培養(yǎng)基圓片的對照組卻未出現(xiàn)黑斑病癥狀，如圖5～圖7 所示。從接種患病葉片中分離出黑斑病病菌，將其與自然環(huán)境下的黑斑病病菌的孢子形態(tài)與菌落形態(tài)進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)二者間的孢子形態(tài)與菌落形態(tài)完全一致，因此斷定青島市海泊河公園月季黑斑病是由鏈格孢病原菌侵染所致。

圖5 自然患病月季葉片

圖6 直接PDA培養(yǎng)基圓片葉片

圖7 人工刺傷接種黑斑病葉片

2.4 黑斑病致病菌的最適生長環(huán)境測定

圖8 為月季黑斑病菌絲在不同溫度、pH 值和光照條件下的生長數(shù)據(jù)。由圖中數(shù)據(jù)能夠得出，月季黑斑病植株的最適生長溫度為30 ℃，黑斑病病原在溫度20～35 ℃都可以正常生長，但不同溫度環(huán)境下黑斑病菌絲的生長性狀存在一定的差異。月季黑斑病植株的最適生長pH 值為6.0，pH 值為4.0～10.0 時(shí)黑斑病菌絲都能夠正常生長，但菌絲的生長性狀存在一定的差異。月季黑斑病植株的最適生長光照條件為全天光照，但在無光照時(shí)也可正常生長。

圖8 環(huán)境因素對黑斑病菌絲生長的影響

3 結(jié)束語

經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，青島市海泊河公園下的月季植株患黑斑病孢子類型為鏈格孢真菌。該真菌在溫度為30 ℃、pH 值為6.0 和全天光照下可以實(shí)現(xiàn)最佳生長。該黑斑病菌絲群初期呈現(xiàn)灰白色，后期逐漸變?yōu)楹诤稚?，分生孢子呈黑褐色棒狀或卵狀，具有橫縱隔膜。