GPC-3和Arg-1在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及其診斷價值

曹夢，高廣甫

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

肝癌是影響全球的公共衛(wèi)生問題，據(jù)2020全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2020)統(tǒng)計，原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因，2020年，全球肝癌新增病例約90.6萬人，死亡83.0萬人。中國人群肝癌新發(fā)病例和死亡病例分別占全世界的45.3%和47.1%[1]。肝癌包括原發(fā)性肝癌和肝轉(zhuǎn)移癌，其中肝細(xì)胞性肝癌占原發(fā)性肝癌的85%～90%。肝細(xì)胞性肝癌和轉(zhuǎn)移癌的治療和預(yù)后有顯著差異，因此，兩者之間的鑒別診斷是至關(guān)重要的。盡管影像方法的進(jìn)步和臨床研究方法的改進(jìn)使很多病例不再需要組織診斷，但細(xì)針穿刺(fine-needle aspiration，F(xiàn)NA)活檢仍然是評估和診斷局灶性肝結(jié)節(jié)和腫塊的重要方法。

通過對蘇木精和伊紅等特殊染色劑染色的標(biāo)本進(jìn)行顯微鏡觀察進(jìn)行組織學(xué)評估，對于腫瘤的病理診斷具有重要意義。然而，在某些情況下，僅通過組織學(xué)評估無法獲得明確診斷，特別是標(biāo)本取材較小時，免疫組化染色就尤其重要[2]。本文旨在探討超聲引導(dǎo)下FNA技術(shù)結(jié)合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC-3)、精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)免疫組化染色在肝細(xì)胞性肝癌及其鑒別診斷中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2016年1月至2021年12月接受FNA的214例患者的病例資料，其中，男153例，女61例；年齡27～89歲，平均(58.6±11.1)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)影像學(xué)檢查提示肝臟占位性病變，需要穿刺活檢明確病變性質(zhì)并鑒別診斷；(2)臨床資料完整；(3)無凝血功能障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者既往肝部腫瘤接受過放療、全身化療等；(2)有明顯出血傾向，存在凝血功能障礙或大量腹水；(3)昏迷不能配合；(4)穿刺路徑有感染病灶。所有患者在操作前簽署知情同意書。

1.2 穿刺方法

1.2.1術(shù)前準(zhǔn)備 所有患者術(shù)前完善影像學(xué)、血常規(guī)、凝血功能等檢查，影像檢查明確病變的具體位置、大小，以及鄰近血管、器官，確定穿刺部位并在皮膚上做標(biāo)記，確定最佳穿刺路徑及穿刺角度。使用18G穿刺活檢針行組織活檢。

1.2.2超聲引導(dǎo)穿刺活檢 患者禁食水6 h，取仰臥位或側(cè)臥位，常規(guī)消毒，鋪巾，采用無菌塑料套包裹探頭后再次確定進(jìn)針點及穿刺路徑，20 g·L-1利多卡因局部麻醉；超聲引導(dǎo)下進(jìn)針，針頭到達(dá)腹膜時囑患者屏住呼吸，術(shù)者持穿刺針刺入肝實質(zhì)，到達(dá)病灶前沿后擊發(fā)，拔出同軸針芯，活檢針通過同軸外鞘從不同方向進(jìn)行多次活檢，取材結(jié)束后，在屏氣狀態(tài)下拔出同軸針。穿刺結(jié)束后，穿刺點消毒，無菌紗布覆蓋固定，多頭腹帶加壓包扎上腹部，臥床6 h以上，監(jiān)測血壓和心率。

1.3 免疫組化

1.3.1檢測方法 采用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的中性甲醛溶液固定組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成4 μm切片，光鏡下觀察。采用EnVision兩步法進(jìn)行免疫組化染色，所用抗體GPC-3、Arg-1均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，DAB顯色和實驗步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性組織作為陽性對照，采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2結(jié)果判讀 患者最終診斷結(jié)果以病理學(xué)診斷聯(lián)合細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)及血清腫瘤標(biāo)志物等綜合判斷結(jié)果為準(zhǔn)。所有切片均經(jīng)2位以上高年資病理醫(yī)生反復(fù)仔細(xì)閱片分析。隨機(jī)選擇5個高倍鏡(400×)視野，每個視野計數(shù)200個腫瘤細(xì)胞，從染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比綜合判斷。染色強(qiáng)度評分：無色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)；陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞(0分)，陽性細(xì)胞數(shù)<10%(1分)，陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%(2分)，陽性細(xì)胞數(shù)>50%(3分)。兩項得分相乘≥2分即判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 GPC-3在不同組織中的表達(dá)Glypican-3陽性表達(dá)定位于胞漿和胞膜，偶爾呈核周強(qiáng)化，呈棕黃色(見圖1)。110例肝細(xì)胞性肝癌中免疫細(xì)胞化學(xué)陽性89例(80.91%)，64例肝臟轉(zhuǎn)移癌中陽性3例(4.69%)，40例肝臟非惡性腫瘤中，僅1例高度異型增生中見GPC-3局灶胞質(zhì)內(nèi)染色，低度異型增生及腺瘤中均未見著色。肝細(xì)胞性肝癌中GPC-3陽性率高于肝臟非惡性腫瘤和肝臟轉(zhuǎn)移癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=75.142、94.336，P<0.001)。見表1。

2.2 Arg-1在不同組織中的表達(dá)Arg-1陽性表達(dá)部位為胞漿和(或)胞核(見圖1)，110例肝細(xì)胞性肝癌中Arg-1免疫細(xì)胞化學(xué)陽性95例(86.36%)，64例轉(zhuǎn)移性肝癌中陽性僅1例(1.56%)，40例肝臟非惡性腫瘤中Arg-1陽性表達(dá)97.50%(肝腺瘤、低度異型增生結(jié)節(jié)、高度異型增生結(jié)節(jié)中均顯示肝細(xì)胞內(nèi)有強(qiáng)烈的彌漫性胞漿反應(yīng))。肝臟非惡性腫瘤與肝細(xì)胞性肝癌中Arg-1陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.070)；肝細(xì)胞性肝癌中Arg-1陽性率高于轉(zhuǎn)移癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=117.641，P<0.001)。見表1。

A為肝細(xì)胞性肝癌(GPC-3呈陽性，400×)；B為肝細(xì)胞性肝癌(Arg-1呈陽性，400×)；C為肝臟轉(zhuǎn)移癌(GPC-3呈陰性，400×)；D為肝臟轉(zhuǎn)移癌(Arg-1呈陰性，400×)。

表1 GPC-3、Arg-1在不同組織類型中的表達(dá)率[n(%)]

2.3 GPC-3和Arg-1在不同分化程度肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)110例肝細(xì)胞性肝癌中高分化36例(32.72%)，中分化44例(40.00%)，低分化30例(27.27%)。高中低分化肝細(xì)胞性肝癌中GPC-3的陽性表達(dá)率分別為66.67%，86.36%，90.00%，GPC-3在低分化肝細(xì)胞性肝癌中敏感度最高，高分化肝細(xì)胞性肝癌中敏感度最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.180，P<0.05)。高中低分化肝細(xì)胞性肝癌中Arg-1的陽性表達(dá)率為100.00%，90.91%，63.33%，腫瘤分化程度越高，敏感度越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.967，P<0.001)。

2.4 GPC-3和Arg-1在不同組織類型中對肝細(xì)胞性肝癌的診斷效能GPC-3在鑒別肝細(xì)胞性肝癌與非肝細(xì)胞性肝癌中的敏感度和特異度分別為80.91%、97.50%；Arg-1在鑒別肝細(xì)胞性肝癌與肝臟轉(zhuǎn)移癌中的敏感度和特異度為86.36%、98.44%。見表2。

表2 GPC-3、Arg-1在不同組織中對肝細(xì)胞性肝癌的診斷效能(%)

3 討論

肝細(xì)胞性肝癌是原發(fā)性肝癌中最常見的組織學(xué)類型，不同類型的肝臟占位病變的治療方法和預(yù)后也不盡相同，如對肝細(xì)胞性肝癌常采用手術(shù)切除、射頻消融、肝移植等方式[3]，而轉(zhuǎn)移癌要依據(jù)原發(fā)腫瘤的惡性程度、部位、患者全身情況等制定治療方案，因此，診斷和鑒別肝細(xì)胞性肝癌與肝臟轉(zhuǎn)移癌、肝臟非惡性腫瘤等對于有效的疾病治療和預(yù)后評估是極其重要的。目前臨床上常用的血清標(biāo)志物、影像學(xué)等檢查手段對于肝癌的診斷有一定的價值，尤其是隨著影像技術(shù)的進(jìn)步，微小肝癌檢出率逐漸增高[2]，然而，對于臨床和影像學(xué)特征不典型的病例，病理學(xué)檢查仍然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

在CT或超聲引導(dǎo)下進(jìn)行的經(jīng)皮肝臟穿刺活檢是一種創(chuàng)傷小、高效、低成本的診斷方法，經(jīng)皮肝臟穿刺活檢結(jié)合細(xì)胞病理學(xué)評估在肝臟占位性病變中的診斷作用被廣泛認(rèn)可[4-5]。有研究表明，經(jīng)皮肝臟穿刺活檢診斷惡性腫瘤的敏感度為67%～100%，特異度超過95%[6-8]。許多免疫組化標(biāo)志物可用于確定肝細(xì)胞性肝癌的診斷，如甲胎蛋白、肝細(xì)胞石蠟抗原、多克隆癌胚抗原、Ki-67等，但這些腫瘤標(biāo)志物診斷肝細(xì)胞性肝癌都有其局限性，尤其是在FNA活檢時，穿刺的腫瘤組織有限，上述標(biāo)志物表現(xiàn)出較低的敏感度，在應(yīng)用于診斷時具有很大的挑戰(zhàn)，而GPC-3和Arg-1近幾年來被認(rèn)為是鑒別診斷肝細(xì)胞性肝癌敏感度較高的標(biāo)志物[9]。

GPC-3是一種膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，通過磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上，在機(jī)體的生長、發(fā)育中起重要作用[10]。GPC-3通常在胎盤組織、成人卵巢、乳腺、間皮細(xì)胞、肺和腎臟中正常表達(dá)，在健康成人的肝臟中表達(dá)缺失，但GPC-3蛋白在肝癌組織中高表達(dá)[11-12]，在肝細(xì)胞性肝癌組織中，GPC-3通過增加細(xì)胞膜上的Wnt蛋白的表達(dá)，再與其受體Frizzled形成復(fù)合物從而激活Wnt信號通路，該通路的異常激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[13]。國內(nèi)外研究報道，GPC-3在63%～91%的肝細(xì)胞性肝癌組織中表達(dá)[14-17]。本研究納入214例異常肝組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測到GPC-3在肝細(xì)胞性肝癌中陽性表達(dá)率為80.91%，與上述文獻(xiàn)報道一致。Timek等[16]的研究結(jié)果顯示，GPC-3在鑒別肝細(xì)胞性肝癌與肝轉(zhuǎn)移癌中的敏感度、特異度分別為83.00%、96.70%。本研究的敏感度、特異度為80.91%、95.31%，由此可見，GPC-3對于鑒別肝細(xì)胞性肝癌與轉(zhuǎn)移癌有較高的敏感度和特異度；GPC-3在鑒別診斷肝細(xì)胞性肝癌與肝臟非腫瘤性病變方面亦有一定的應(yīng)用價值。本研究發(fā)現(xiàn)GPC-3在鑒別診斷肝細(xì)胞性肝癌與肝臟非惡性腫瘤的敏感度、特異度為80.91%、97.50%，因此，GPC-3在鑒別肝臟良惡性結(jié)節(jié)中也表現(xiàn)出較高的敏感度和特異度，但GPC-3免疫反應(yīng)也可以是局灶性的。免疫染色陰性不能排除肝細(xì)胞癌的診斷，還需結(jié)合臨床、生化、影像學(xué)檢查結(jié)果綜合判定。GPC-3不僅是一種高度特異的診斷肝細(xì)胞性肝癌的生物標(biāo)志物，同時也是肝細(xì)胞性肝癌免疫治療的有效靶點。目前，使用人源化抗GPC-3細(xì)胞毒抗體、治療肽/DNA疫苗、免疫毒素療法和基因療法正表現(xiàn)出很好的發(fā)展前景[10]。

精氨酸有兩種不同的亞型，分別為精氨酸酶-1(Arg-1)和精氨酸酶-2(Arg-2)，他們催化相同的生化反應(yīng)，但在細(xì)胞表達(dá)、調(diào)節(jié)和定位方面不同。Arg-1是一種催化精氨酸在尿素循環(huán)中水解為鳥氨酸和尿素的酶，正常情況下主要在肝細(xì)胞中表達(dá)，在肝尿素循環(huán)中扮演著重要角色；Arg-2是一種線粒體酶，主要在腎、小腸、前列腺、乳腺和巨噬細(xì)胞中表達(dá)[18-19]。有研究表明，Arg-1對于肝細(xì)胞性肝癌的診斷具有較高的敏感度和特異度，尤其是在高分化肝細(xì)胞性肝癌中，是肝組織標(biāo)志物的最佳選擇，敏感度在79%～100%[20-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，Arg-1在86.36%的肝細(xì)胞性肝癌中表達(dá)，與文獻(xiàn)報道基本一致，在肝臟轉(zhuǎn)移癌中，僅1例胰腺癌中Arg-1局灶表達(dá)，余轉(zhuǎn)移癌均未檢測到Arg-1陽性表達(dá)。Atta和Fujiwara等[22-23]也報道了這一現(xiàn)象，即在胰腺癌中檢測到Arg-1局灶弱陽性表達(dá)。Yan等[21]及其團(tuán)隊在1例前列腺癌和1例膽管癌中檢測到Arg-1陽性表達(dá)。這些結(jié)果都證實了Arg-1是肝臟分化的一個高度敏感的標(biāo)志物，并且在鑒別診斷肝細(xì)胞性肝癌與肝臟轉(zhuǎn)移癌表現(xiàn)出高的敏感度和特異度。

目前肝細(xì)胞癌病理診斷的主要困難包括：(1)異型增生結(jié)節(jié)、腺瘤等非惡性腫瘤與分化良好的肝細(xì)胞性肝癌的鑒別；(2)低分化肝細(xì)胞性肝癌與轉(zhuǎn)移癌的鑒別。GPC-3對于以上兩個問題的解決均有幫助，而Arg-1在腺瘤等良性肝細(xì)胞和肝細(xì)胞性肝癌中均有表達(dá)，因此它只對鑒別低分化肝細(xì)胞性肝癌與轉(zhuǎn)移癌有意義。在實際工作中，應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用不同的免疫組化抗體組合，并結(jié)合臨床表現(xiàn)、生化、影像等檢查綜合判定，以提高診斷的準(zhǔn)確性。