miR-101通過(guò)調(diào)控c-met對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63惡性生物學(xué)行為的影響*

王若章，樓錦博，顧增輝

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇三醫(yī)院骨科，杭州 310013)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是在兒童和成年人中常見(jiàn)的一種原發(fā)骨惡性腫瘤，由于具有高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)性，其有效治療一直是臨床從業(yè)者面臨的難題。微RNA(microRNA，miR)是一類(lèi)非編碼RNA，其通過(guò)調(diào)控下游靶蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯，參與多種生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-101在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，如促進(jìn)結(jié)腸癌、肝癌及卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[1-3]。此外，本研究前期的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)OS組織中存在差異性表達(dá)的基因，miR-101下調(diào)明顯，較正常骨組織下調(diào)5倍。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-met)表達(dá)異常與多種癌癥有關(guān)，肝癌組織c-met表達(dá)上調(diào)，靶向抑制c-met蛋白表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[4]；此外，c-met抑制對(duì)轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌增殖、血管生成和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有直接抑制作用，而且通過(guò)免疫檢查點(diǎn)發(fā)揮間接抗腎細(xì)胞癌作用[5]。miR-101是否能通過(guò)調(diào)節(jié)c-met的表達(dá)影響OS的惡性行為學(xué)仍需進(jìn)一步研究。因此，本研究通過(guò)上調(diào)或下調(diào)MG63細(xì)胞中miR-101表達(dá)，探討miR-101對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響及其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系

OS細(xì)胞MG63購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2儀器與試劑

miR-101模擬物(miR-101 mimic)、模擬物陰性對(duì)照片段(mimic-NC)、miR-101抑制劑(miR-101 inhibitor)、抑制劑陰性對(duì)照片段(inhibitor-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miR-101、U6引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；c-met、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

MG63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，每2天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第4代MG63細(xì)胞分為對(duì)照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組。除對(duì)照組外，根據(jù)LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)將mimic-NC、miR-101 mimic、inhibitor-NC及miR-101 inhibitor分別轉(zhuǎn)染入對(duì)應(yīng)組別的細(xì)胞中，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染成功率達(dá)85%后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR法檢測(cè)miR-101相對(duì)表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，按照SYBR Green試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCT表示miR-101相對(duì)表達(dá)水平，miR-101引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-101引物序列

1.2.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率

收集轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，細(xì)胞密度為1×105/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后每孔加入MTT溶液50 μL，4 h后棄去原有培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，混合均勻后，室溫避光孵育10 min，置于波長(zhǎng)為570 nm的酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(A570)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A570值/對(duì)照組A570值)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞于流式管中，3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，加入500 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，離心后加入500 μL結(jié)合緩沖液，制成細(xì)胞懸液，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)結(jié)合液混勻，再加入10 μL碘化丙啶(PI)充分混勻，避光冰浴15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

取DMEM培養(yǎng)基稀釋后的基質(zhì)膠100 μL鋪于Transwell小室的上室中，Transwell小室的下室中加入500 μL DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取轉(zhuǎn)染48 h后的MG63細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，Transwell小室中加入150 μL細(xì)胞懸液，48 h后去除下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-101與c-met的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)starBase預(yù)測(cè)miR-101與c-met具有靶向結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建包含靶向結(jié)合位點(diǎn)序列的c-met 3′-UTR野生型(c-met wt)和突變型(c-met mut)重組質(zhì)粒。將第4代未經(jīng)轉(zhuǎn)染的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞按1×105/孔的密度接種到24孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，將miR-101 mimic、mimic NC分別與c-met wt或c-met mut重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，48 h后根據(jù)雙熒光素酶試劑盒說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè)熒光素酶活性，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對(duì)活性。

1.2.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，吸取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白水平，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。120 V恒壓電泳2 h，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，胎牛血清室溫封閉1 h，c-met、p-Akt、AKT、p-PI3K、PI3K、GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-101相對(duì)表達(dá)水平比較

對(duì)照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組miR-101相對(duì)表達(dá)水平分別為2.02±0.11、2.05±0.16、6.82±0.15、2.03±0.18、1.10±0.15，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=678.132，P<0.001)。與對(duì)照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組miR-101相對(duì)表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與對(duì)照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組miR-101相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組miR-101相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組miR-101相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.2 細(xì)胞存活率比較

各組細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與對(duì)照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 細(xì)胞凋亡率比較

各組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與對(duì)照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與對(duì)照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

2.4 侵襲細(xì)胞數(shù)比較

各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與對(duì)照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)；與對(duì)照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率及侵襲細(xì)胞數(shù)比較

A：對(duì)照組；B：mimic-NC組；C：miR-101 mimic組；D：inhibitor-NC組；E：miR-101 inhibitor組。

A：對(duì)照組；B：mimic-NC組；C：miR-101 mimic組；D：inhibitor-NC組；E：miR-101 inhibitor組。

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染miR-101 mimic后，miR-101 mimic+c-met wt質(zhì)粒的熒光素酶活性(0.44±0.06)較miR-NC+c-met wt質(zhì)粒(1.05±0.08)明顯降低(t=10.566，P<0.001)；但對(duì)c-met mut質(zhì)粒的熒光素酶活性無(wú)影響，miR-101 mimic+c-met mut與miR-NC+c-met mut質(zhì)粒的熒光素酶活性分別為1.05±0.06、1.04±0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.222，P=0.835)。

2.6 細(xì)胞中c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平比較

各組c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；與對(duì)照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平均無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組細(xì)胞中c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平比較

續(xù)表3 各組細(xì)胞中c-met、p-PI3K及p-Akt相對(duì)表達(dá)水平比較

A：對(duì)照組；B：mimic-NC組；C：miR-101 mimic組；D：inhibitor-NC組；E：miR-101 inhibitor組。

3 討 論

OS是骨骼系統(tǒng)常發(fā)生的惡性腫瘤，好發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端，常見(jiàn)于膝關(guān)節(jié)。目前對(duì)OS的治療以化療為主，但5年生存率不甚理想，所以O(shè)S仍是醫(yī)療上亟待解決的難題。既往研究表明，miRNA在OS的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用，阻斷miR-27a-3p可降低紫杉醇耐藥骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性，miR-329-3p可增強(qiáng)OS癌細(xì)胞順鉑敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲[6-7]。miR-101已被報(bào)道在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[8-9]，所以本研究通過(guò)敲降或上調(diào)MG63細(xì)胞中miR-101的表達(dá)，探討miR-101對(duì)OS的影響。

miR-101在結(jié)腸癌、肝癌等癌癥中均發(fā)揮抗癌作用，而且能逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞順鉑耐藥性[10-12]。在OS中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA DSCAM-AS1通過(guò)海綿吸附降低miR-101表達(dá)，癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)[13]；血清miR-101水平與總生存期有關(guān)，可作為OS臨床診斷和預(yù)后的一個(gè)重要生物標(biāo)志物[14]。本研究通過(guò)將miR-101 mimic及miR-101 inhibitor轉(zhuǎn)染入MG63細(xì)胞，上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中miR-101的表達(dá)，探討miR-101對(duì)MG63細(xì)胞惡性行為學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-101表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞侵襲能力，而下調(diào)miR-101后，細(xì)胞增殖、侵襲能力增強(qiáng)，凋亡率降低。該結(jié)果提示，miR-101可抑制OS癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)其侵襲能力。

c-met激活后可調(diào)控下游多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過(guò)這些途徑調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖和分化。PI3K/Akt信號(hào)通路在促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路激活可促進(jìn)食管鱗癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞遷移和侵襲[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，c-met可激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和侵襲活性[17]。此外，miR-152激活c-met/PI3K/Akt信號(hào)通路可增強(qiáng)OS癌細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的耐藥性，使OS預(yù)后不良[18]。但是抑癌因子miR-101在OS中發(fā)揮抑癌作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)c-met/PI3K/Akt信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)上調(diào)或敲降MG63細(xì)胞中miR-101的表達(dá)，探討miR-101對(duì)c-met/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，Western blot檢測(cè)c-met、p-PI3K、p-Akt表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MG63細(xì)胞中c-met、p-PI3K、p-Akt表達(dá)升高，miR-101表達(dá)上調(diào)可降低c-met、p-PI3K、p-Akt表達(dá)，而下調(diào)miR-101后c-met、p-PI3K、p-Akt表達(dá)升高。結(jié)果提示，miR-101抑制OS中c-met/PI3K/Akt信號(hào)通路。

綜上所述，miR-101可抑制OS癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)其侵襲能力，并可能通過(guò)抑制c-met/PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用，為臨床治療OS提供了理論依據(jù)。但是本研究存在一定不足之處：(1)僅在細(xì)胞水平證明miR-101參與調(diào)控OS的生物行為學(xué)，缺乏體內(nèi)研究進(jìn)行佐證；(2)對(duì)于機(jī)制的研究?jī)H檢測(cè)了上調(diào)或下調(diào)miR-101后，OS癌細(xì)胞中c-met/PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況，缺乏該信號(hào)通路對(duì)OS細(xì)胞惡性行為學(xué)的直接作用研究。因此，后期將補(bǔ)充體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，建立OS移植瘤大鼠模型，上調(diào)或下調(diào)miR-101后，檢測(cè)移植瘤生長(zhǎng)情況，并明確c-met/PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白在腫瘤中的表達(dá)情況，完成體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的相互佐證。