乳酸菌發(fā)酵黑莓汁增加胞外多糖工藝初探

戴意強(qiáng) 單成俊 劉小莉 吳寒 王英 程先玲 郜海燕 韓延超 周劍忠 夏秀東

摘要：為增加黑莓汁中乳酸菌胞外多糖含量，利用產(chǎn)胞外多糖乳酸菌MB2-1和JX5發(fā)酵黑莓汁，并測定發(fā)酵過程中黑莓汁的pH值、黏度及多糖含量隨時間的變化情況，以確定用于發(fā)酵黑莓汁的乳酸菌種類和碳源。結(jié)果表明，添加葡萄糖作為碳源時，乳酸菌MB2-1和JX5發(fā)酵在32 h時胞外多糖產(chǎn)量最高，分別為2.75 g/L和3.06 g/L，說明將乳酸菌JX5作為發(fā)酵菌株，葡萄糖作為碳源添加到黑莓汁中進(jìn)行發(fā)酵，可增加黑莓汁中乳酸菌胞外多糖含量。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;黑莓汁;多糖;碳源;發(fā)酵;黏度

中圖分類號： TS275.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0214-05

收稿日期：2019-09-11

基金項目：江蘇省科技計劃（編號：BE2018367）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（18）2017];農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗室、浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗室開放課題。

作者簡介：戴意強(qiáng)（1995—），男，江蘇南京人，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yq-dai@foxmail.com。

通信作者：夏秀東，博士，副研究員，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：86084056@163.com。

黑莓漿果風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，含有多種具有生物活性的化合物，是釀酒和生產(chǎn)果汁、果醬、醫(yī)療保健品等的天然原料。黑莓中富含維生素C、酚酸、鞣花酸、鞣花素、類黃酮（包括花青素）和類胡蘿卜素等促進(jìn)健康的物質(zhì)，具有抗氧化、代謝調(diào)節(jié)、消除疲勞、延緩衰老、提高免疫力等作用[1-2]。因此隨著人們生活水平的提高和對健康生活的追求，研究和開發(fā)黑莓相關(guān)的產(chǎn)品將具有廣闊的前景。

胞外多糖（EPS）是一類由特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的一類次級代謝產(chǎn)物[3]。EPS具有多種生理活性功能，可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抗腫瘤、降低血清中膽固醇[4]、降血壓、抗氧化和改善人體腸道微生態(tài)環(huán)境[5]等作用。乳酸菌EPS是一類來源可靠安全，對人體無毒副作用，并且具有獨(dú)特的理化和流變學(xué)特性的物質(zhì)，因此可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑應(yīng)用到食品工業(yè)中，已經(jīng)成為了一種天然安全無公害的食品級添加劑[6]。

筆者研究了2株產(chǎn)胞外多糖乳酸菌在添加不同碳源的條件下發(fā)酵黑莓汁中pH值、黏度和產(chǎn)胞外多糖情況，以期開發(fā)一種新型產(chǎn)胞外多糖乳酸菌發(fā)酵黑莓汁飲料。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

黑莓來源于江蘇省南京市溧水區(qū)白馬種植基地;植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JX5，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室保存;瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）MB2-1，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品微生物研究室保存。

1.2?試劑及儀器

試劑：MRS肉湯培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）;濃硫酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司）;苯酚、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

儀器：3K15離心機(jī)[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司];DV-1+Pro黏度計（上海尼潤智能科技有限公司）;FiveEasy Plus pH計[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司];Epoch酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）;Agilent 1290高效液相色譜（安捷倫科技有限公司）。

1.3?試驗方法

1.3.1?黑莓果汁制備工藝

黑莓果汁制備工藝流程如下：黑莓漿果清洗→打漿→離心取上清→加入碳源（3%葡萄糖、3%蔗糖、1%乳糖）→85 ℃ 巴氏殺菌 20 min→接種→發(fā)酵→85 ℃巴氏殺菌 20 min→成品。

1.3.2?乳酸菌培養(yǎng)及對黑莓汁的接種

挑取活化好的乳酸菌單菌落接種到液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。將一定體積含乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基離心去上清，用無菌水洗滌沉淀2次，再加入同體積無菌水，混勻，按3%的接種量分別接種到處理過的黑莓汁中。

1.3.3?黑莓汁中糖分組成和含量的測定

樣品經(jīng) 11 000 r/min 離心后過0.45 μm濾膜，稀釋10倍后測定糖分組成。用超純水配制10 mg/mL棉子糖、蔗糖、葡萄糖、木糖和果糖母液，待用。標(biāo)準(zhǔn)液濃度依次為1.0、0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜分析條件為流動相：超純水;流動相流速：0.5 mL/min;色譜柱：Agilen Hi-Plex Ca糖分析柱;檢測器：示差折光檢測器;柱溫：80 ℃;進(jìn)樣量：25 μL。

1.3.4?發(fā)酵黑莓汁pH值的測定

將發(fā)酵0、32、120 h的黑莓汁搖勻后，用pH計測定不加入碳源、加入葡萄糖、蔗糖以及乳糖的發(fā)酵黑莓汁pH值。

1.3.5?發(fā)酵黑莓汁黏度的測定

用量筒量取 30 mL 發(fā)酵0、32、120 h的黑莓汁，用黏度計測定不加入碳源、加入葡萄糖、蔗糖以及乳糖的發(fā)酵黑莓汁的黏度，轉(zhuǎn)子型號為0號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為 60 r/min。

1.3.6?發(fā)酵黑莓汁多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵黑莓汁中的多糖含量。稱取樣品1.0 g（精確至0.001）置于50 mL具塞離心管中，緩慢加入20 mL無水乙醇，渦旋振蕩，混勻，4 ℃提取 1 h，再用4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液。不溶物用80%乙醇溶液洗滌、離心，用去離子水將沉淀超聲溶解后再次離心，取上清液，殘渣用去離子水洗滌2次。將所有上清液轉(zhuǎn)入到50 mL容量瓶中，加去離子水定容。

分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液置于20 mL具塞試管中，并用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL。向試樣中先后加入1.0 mL苯酚和5.0 mL濃硫酸，混勻后于30 ℃下水浴20 min，并于490 nm處測定吸光度。

2?結(jié)果與分析

2.1?黑莓汁中糖分組成和含量

利用液相色譜儀測定黑莓汁中糖分組成和含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所用品種的黑莓汁中糖分組成為葡萄糖和果糖。圖1是糖類標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰，棉子糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、果糖分離效果好，保留時間分別為11.503、12.452、13.604、15.028、16.920 min。黑莓汁中糖分的HPLC分析結(jié)果見圖2，可以看出，糖分分離效果很好，根據(jù)出峰時間可知，黑莓汁中含有葡萄糖和果糖。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=174 121.422 16x-1 214.766 07， r2=0.996 3）和果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=224 217.087 47x-1 650.563 79，r2=0.997 7）得到，黑莓汁中葡萄糖和果糖含量分別為26.70 mg/mL和20.97 mg/mL。說明黑莓汁中含有豐富的糖分，不添加糖分或者添加適量的糖分即可滿足乳酸菌生長代謝所需。

2.2?發(fā)酵黑莓汁pH值變化

乳酸菌可以利用糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，但由于對不同糖類的利用能力有所不同，乳酸菌在不同碳源下的生長狀況和產(chǎn)酸能力不同。

本研究探討了不同碳源對產(chǎn)胞外多糖乳酸菌MB2-1發(fā)酵黑莓汁pH值的影響（圖3-A）。與發(fā)酵0 h的pH值相比，相同碳源下乳酸菌MB2-1發(fā)酵黑莓汁在32、120 h時的pH值顯著增加（P<005）;除添加葡萄糖和乳糖的黑莓汁外，相同碳源下發(fā)酵黑莓汁pH值在32、120 h 之間無顯著性差異（P>0.05）。添加不同的碳源和不添加糖分之間在0、32 h時發(fā)酵液pH值無顯著性差異（P>0.05）。乳酸菌MB2-1發(fā)酵黑莓汁在發(fā)酵過程中pH值維持在2.98～3.26范圍內(nèi)。

乳酸菌JX5發(fā)酵添加不同碳源的黑莓汁pH值變化，圖3-B所示。乳酸菌JX5發(fā)酵黑莓汁在 0 h 時pH值維持在3.0左右;發(fā)酵32 h時，不添加碳源或者添加葡萄糖、乳糖作為碳源之間pH值無顯著差異（P>0.05），而添加蔗糖的發(fā)酵黑莓汁pH值較低。與發(fā)酵32 h時添加乳糖的發(fā)酵黑莓汁pH值相比，發(fā)酵120 h時添加乳糖的發(fā)酵黑莓汁pH值顯著降低（P<0.05）。除添加乳糖的發(fā)酵黑莓汁外，32 h 和120 h發(fā)酵黑莓汁pH值無顯著性差異（P>005）。

在添加碳源和不添加碳源的情況下，與0 h的pH值相比，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5發(fā)酵黑莓汁pH值在32 h時顯著上升（P<0.05），這可能是因為一方面隨著發(fā)酵時間的增加，黑莓汁中碳源含量減少限制了乳酸菌的生長，且乳酸菌在衰退期菌體發(fā)生自溶，氨基氮含量增加，造成pH值上升。另一方面可能由于發(fā)酵過程中乳酸菌將黑莓汁中的有機(jī)酸消耗或轉(zhuǎn)化為其他有機(jī)酸。

2.3?發(fā)酵黑莓汁黏度變化

乳酸菌發(fā)酵過程中一般采用間接的方法來定量測定EPS的產(chǎn)量[7]，其中對黏度的測定就是一種間接測定方法，但是黏度和EPS產(chǎn)量沒有必然的對應(yīng)關(guān)系[8-9]。

不同碳源對乳酸菌MB2-1發(fā)酵黑莓汁黏度的影響如圖4-A所示。在0 h時，不添加碳源和添加葡萄糖、蔗糖、乳糖的黑莓汁黏度分別為5.39、587、5.73、5.35 cp。在32 h時，發(fā)酵黑莓汁黏度顯著下降（P<0.05），分別下降為4.99、515、4.79、4.87 cp。與發(fā)酵32 h時的發(fā)酵黑莓汁相比，發(fā)酵120 h時不添加碳源和添加葡萄糖的發(fā)酵黑莓汁黏度顯著增加（P<0.05），而添加蔗糖的發(fā)酵黑莓汁黏度顯著降低（P<0.05）。

如圖4-B所示，乳酸菌JX5發(fā)酵黑莓汁在不添加碳源和添加葡萄糖、蔗糖、乳糖情況下起始黏度分別為5.22、5.67、5.40、5.40 cp;在32 h時，發(fā)酵黑莓汁黏度分別為5.00、5.36、5.09、4.98 cp。與發(fā)酵32 h時的發(fā)酵黑莓汁相比，乳酸菌JX5發(fā)酵120 h后，不添加碳源和添加葡萄糖的黑莓汁黏度顯著上升（P<0.05），分別為5.74 cp和5.75 cp。除添加蔗糖和乳糖的黑莓汁外，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5發(fā)酵黑莓汁黏度隨時間的增加先減小后增大，這可能是由于乳酸菌生長前期利用黑莓汁中如糖類等具有黏度的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵黑莓汁整體黏度下降，而發(fā)酵后期，發(fā)酵黑莓汁中產(chǎn)生了其他具有黏性的物質(zhì)，如乳酸菌胞外多糖等。值得注意的是在MB2-1和JX5發(fā)酵120 h后添加蔗糖發(fā)酵黑莓汁黏度顯著下降，這可能是因為黑莓汁中的微生物利用了黑莓汁中存在的多糖。

2.4?發(fā)酵黑莓汁多糖含量變化

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外部的糖類化合物。由圖5可知，是否加入碳源或者加入不同的碳源，乳酸菌發(fā)酵黑莓汁多糖含量隨時間的增加先增加后減少，這是因為乳酸菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多糖，當(dāng)黑莓汁中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡時，多糖可能被再次利用。在添加葡萄糖、蔗糖、乳糖情況下，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5發(fā)酵黑莓汁中多糖含量在32 h時顯著上升（P<0.05），分別為2.75、2.69、2.41 g/L和3.06、2.52、2.50 g/L。乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5發(fā)酵添加不同碳源的黑莓汁在0 h時多糖含量無顯著性差異（P>0.05）。在添加葡萄糖、蔗糖、乳糖情況下，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5發(fā)酵黑莓汁在120 h 時多糖含量顯著下降（P<0.05），分別為160、1.13、161 g/L和1.47、1.27、1.82 g/L。由圖5可知，乳酸菌MB2-1和乳酸菌JX5在添加葡萄糖作為碳源時，發(fā)酵32 h的黑莓汁中胞外多糖含量