不同煤階煤的生物產(chǎn)氣特征差異研究

楊玉亮 ，賈奇鋒

(1.山西大同大學(xué) 煤炭工程學(xué)院，山西 大同 037003；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京) 能源與礦業(yè)學(xué)院，北京 100083；3.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京) 能源學(xué)院，北京 100083)

0 引 言

生物成因煤層氣是煤中大分子有機(jī)質(zhì)經(jīng)特定微生物降解轉(zhuǎn)化為可溶性有機(jī)質(zhì)[3-5](長(zhǎng)鏈脂肪酸、烷烴、低分子量芳烴等)，然后繼續(xù)被降解成乙酸、H2和CO2等小分子，最后被不同產(chǎn)甲烷菌群利用生成甲烷[6-8]。雖然溫度、鹽度、pH值、Eh值和微量元素含量對(duì)煤的微生物厭氧降解體系影響已被國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者所證實(shí)[9-11]，但煤階是影響煤生物產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)室研究的前提。STRAPOC等[12]假設(shè)生物CH4的生成潛力與煤階增加之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，他們將這一結(jié)論歸因于高階煤含有較高的芳香烴含量。宋金星等[13]探討了不同煤階煤的顯微組分與生物甲烷代謝之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)煤中H/C比與生物產(chǎn)氣效率具有一致性。WAWRIK等[14]報(bào)告稱(chēng)，生物CH4生成潛力和煤階之間沒(méi)有相關(guān)性，并得出結(jié)論認(rèn)為，煤的活化和較強(qiáng)的微生物群落結(jié)構(gòu)是生物CH4生成的主要因素。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)生物成因煤層氣生成的液相成因機(jī)理已經(jīng)有了較深入的研究。陳林勇等[15]研究了無(wú)煙煤生物產(chǎn)氣不同階段發(fā)酵液中液相產(chǎn)物的變化特征，認(rèn)為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和長(zhǎng)鏈烷烴在煤生物產(chǎn)甲烷過(guò)程中發(fā)揮中重要的作用。趙同謙等[16]探討了煤生物產(chǎn)氣過(guò)程中有機(jī)液相產(chǎn)物的變化特征，得出發(fā)酵液中TOC含量的變化周期與產(chǎn)氣時(shí)期具有一致性。XIA等[17]發(fā)現(xiàn)煤樣通過(guò)白腐菌預(yù)處理后可增加中間液相有機(jī)物(包括二十七烷、乙酸、丁酸、酰胺類(lèi)等)的生成量，同時(shí)水解期明顯縮短。煤制生物甲烷液相成因機(jī)理研究中發(fā)酵底物較為單一，對(duì)不同煤階煤生物降解過(guò)程液相產(chǎn)物對(duì)比還沒(méi)有形成共識(shí)。

微生物吸附是由其表面結(jié)構(gòu)以及物理性質(zhì)決定的[18-19]。微生物因其表面特有的有機(jī)大分子結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)、脂多糖等)，使其能吸附于煤表面[20]。同時(shí)，煤的多孔結(jié)構(gòu)和粗糙基質(zhì)也有助于微生物的吸附[21]。微生物生物膜是動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的、非隨機(jī)的結(jié)構(gòu)[22-23]，煤與細(xì)菌之間的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化需要生物膜，如果生物膜在煤表面形成，它們可能是釋放和轉(zhuǎn)化有機(jī)物的宿主生物。有學(xué)者研究結(jié)果表明，表面活性劑可以改變煤顆粒表面性質(zhì)，增加細(xì)菌在煤顆粒表面的吸附能力，并促進(jìn)生物膜的形成，從而利用微生物提高煤層氣產(chǎn)量的關(guān)鍵[24-25]。

基于煤的生物產(chǎn)氣潛力與煤階的耦合關(guān)系，眾多研究均從煤結(jié)構(gòu)的分析角度入手，鮮有關(guān)注不同煤階煤生物產(chǎn)氣過(guò)程中發(fā)酵液液相產(chǎn)物變化規(guī)律以及菌群附著特征與甲烷產(chǎn)量之間的協(xié)同效應(yīng)。因此，本文用液相分析結(jié)果與掃描電鏡測(cè)試，來(lái)反映不同煤階煤樣厭氧生物降解過(guò)程中生物甲烷出現(xiàn)差異的可能性原因，為煤的清潔利用提供借鑒。

1 不同煤階煤的生物產(chǎn)氣試驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)材料

分別在山西麻家梁煤礦、山西沙曲煤礦和河南平頂山煤礦采集新鮮的長(zhǎng)焰煤、焦煤和瘦煤作為試驗(yàn)煤樣，工業(yè)分析和元素分析分別按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015進(jìn)行，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)前將煤樣放入60 ℃的烘干箱中烘干24 h(為了去除煤樣水分以及殘余氣)，然后將其粉碎至60～80目(0.2～0.3 mm)，并在35 ℃下干燥24 h，密封保存。

表1 煤樣的工業(yè)分析與元素分析

1.2 生物產(chǎn)氣試驗(yàn)

試驗(yàn)所用產(chǎn)甲烷菌菌種由各個(gè)礦井井口排采水經(jīng)過(guò)富集、馴化培養(yǎng)得到。在500 mL錐形瓶中加入15 g煤樣、200 mL水、70 mL培養(yǎng)基和30 mL菌液，營(yíng)養(yǎng)液具體準(zhǔn)備方式見(jiàn)文獻(xiàn)[26]。

設(shè)置3種煤樣的生物產(chǎn)氣試驗(yàn)，每組3個(gè)平行樣。3組發(fā)酵試驗(yàn)均在35 ℃下恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，采用排水集氣法每隔5 d進(jìn)行氣體含量測(cè)試，甲烷定量分析使用氣相色譜儀(Agilent 7890GC)。同時(shí)采集3種發(fā)酵試驗(yàn)第0天、第10天、第15天、第20天和產(chǎn)氣終止階段(第30天)的發(fā)酵液，供后續(xù)液相有機(jī)物成分測(cè)定。

長(zhǎng)沙為湖南省省會(huì)，位于湖南的東部偏北，坐標(biāo)為 111°53′—114°5′E，27°51′—28°40′N(xiāo)，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，春、夏季冷暖氣流交匯頻繁，容易產(chǎn)生強(qiáng)對(duì)流天氣及雷暴活動(dòng)。長(zhǎng)沙地區(qū)年平均氣溫為17.4 ℃，年平均降水總量為 1 475.7 mm，平均降水日數(shù)為 154.7 d，年平均雷暴日為 47.7 d，屬多雷區(qū)。 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2002—2017年長(zhǎng)沙地區(qū)共計(jì)發(fā)生雷電災(zāi)害事故1 807起，造成22人死亡，30人受傷，直接經(jīng)濟(jì)損失1 584.92萬(wàn)元。

1.3 有機(jī)物成分測(cè)定

采用以下GC-MS條件對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析：美國(guó)安捷倫(GC-MS 7890-5977A氣相色譜儀/質(zhì)譜儀)，配有游離脂肪酸相(FFAP)色譜柱(30 m×0.25 μm×0.5 mm)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NIST)2014數(shù)據(jù)庫(kù)。測(cè)定條件為：載氣為99.999%的高純氦氣，載氣流速為30 mL/min；柱溫采用程序升溫至50 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升至240 ℃，保持3 min。

1.4 掃描電鏡檢測(cè)

按照前人的研究進(jìn)行固定溶液與磷酸緩沖液的配制。掃描電鏡樣品制備：發(fā)酵后煤樣在固定溶液中浸泡2 h，之后用磷酸緩沖液清洗4次，然后進(jìn)行乙醇梯度脫水：25%、50%、75%、95%乙醇各浸泡十次，每次時(shí)間為20～30 min，之后用100%乙醇浸泡3次，每次時(shí)間為1 h。最后樣品在35 ℃烘干箱中進(jìn)行干燥處理。用Edwards S 150B濺射鍍膜機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行1 min的金濺射，并用捷克Tescan公司VEGA TS 5136 XM掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)[27]。

100 mL的1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH=7.2)的配制：添加6.8 mL濃度1 mol/L NaH2PO4，用1 mol/L Na2HPO4調(diào)整pH，直到pH為7～7.2，用滅菌好的去離子水至100 mL。

100 mL的固定溶液制備：分別添加50 mL 4%多聚甲醛、8 mL 25%戊二醛、20 mL上述磷酸鈉緩沖液和22 mL滅菌后的去離子水。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物產(chǎn)氣量分析

不同煤階煤的生物產(chǎn)氣累積產(chǎn)氣量、甲烷濃度與甲烷產(chǎn)量進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖1所示。可以看出，生物產(chǎn)氣總量與煤階成反比，煤階越高，生物產(chǎn)氣總量越低，并且低煤階煤的生物甲烷產(chǎn)量明顯高于高煤價(jià)煤，說(shuō)明低階煤更適合作為生物成氣的底物。

圖1 累積產(chǎn)氣量與甲烷產(chǎn)量變化特征Fig.1 Change characteristics of cumulative biogas and methane production

煤階不同，產(chǎn)氣階段也有所差異。煤階越低，煤的生物產(chǎn)氣3個(gè)階段越明顯，第1階段：緩慢增長(zhǎng)→快速增長(zhǎng)；第2階段：快速增長(zhǎng)→緩慢增長(zhǎng)；第3階段：緩慢增長(zhǎng)→產(chǎn)氣停止。對(duì)煤生物成氣有利的第2階段：長(zhǎng)焰煤的第2階段是7～22 d，瘦煤的第2階段是15～22 d，相對(duì)長(zhǎng)焰煤持續(xù)時(shí)間較短，焦煤的生物成氣反應(yīng)較為平緩，沒(méi)有明顯的大幅上升階段。

2.2 液相產(chǎn)物分析

每組試驗(yàn)制作5個(gè)平行樣，分別在5、15、20和30 d取50 mL發(fā)酵液(充分搖勻后提取)，進(jìn)行離心處理，離心速度：9 000 r/min，離心機(jī)溫度：10 ℃。離心后取上清液進(jìn)行GC-MS測(cè)試，圖2、圖3和圖4所示，表2、表3和表4列舉了對(duì)應(yīng)圖中峰號(hào)所對(duì)應(yīng)的化合物。

1，…，14—峰號(hào)圖2 長(zhǎng)焰煤厭氧發(fā)酵過(guò)程中GC-MS譜圖Fig.2 GC-MS chromatogram in process of anaerobic fermentation for long flame coal

1，…，14—峰號(hào)圖3 焦煤厭氧發(fā)酵過(guò)程中GC-MS譜圖Fig.3 GC-MS chromatogram in process of anaerobic fermentation for coking coal

1，…，14—峰號(hào)圖4 瘦煤生物制氣發(fā)酵液GC-MS譜圖Fig.4 GC-MS chromatogram in process of anaerobic fermentation for lean coal

表2 長(zhǎng)焰煤厭氧發(fā)酵過(guò)程中GC-MS半定性結(jié)果匯總

長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組試驗(yàn)開(kāi)始階段(第0天)就有大分子物質(zhì)存在，與在發(fā)酵第10天化合物含量有較大變化，部分芳香環(huán)和雜環(huán)化合物豐度降低，VFA和甲基化合物等物質(zhì)的豐度升高，如丁酸、戊酸等，而VFA被認(rèn)為是生物甲烷產(chǎn)生的前提，甲基類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)甲基營(yíng)養(yǎng)途徑參與成氣，說(shuō)明該階段的發(fā)酵液具有較大的產(chǎn)氣潛力。在發(fā)酵第15天有新的大分子物質(zhì)產(chǎn)生，如2,4-二叔丁基苯酚(14號(hào)峰)等，這可能緣于水解菌的降解。在第20天并未檢測(cè)到大量的VFA及低分子化合物，可能由于隨著產(chǎn)甲烷菌群對(duì)發(fā)酵環(huán)境逐步適應(yīng)，其活性增強(qiáng)，對(duì)VFA等低分子物質(zhì)的消耗速率大于生成速率，并且對(duì)比第20天與第15天，所有化合物(包括芳香環(huán)和雜環(huán)化合物)均處于下降狀態(tài)，這一階段微生物降解劇烈，這可能是這個(gè)期間出現(xiàn)產(chǎn)氣高峰的原因，這與Orem等學(xué)者的研究結(jié)果相似[28]。第30天期間化合物豐度出現(xiàn)上升趨勢(shì)，但產(chǎn)氣幅度不大，可能是前期部分水解菌活性降低，有機(jī)大分子物質(zhì)不能充分被利用。

焦煤試驗(yàn)組發(fā)酵過(guò)程液相產(chǎn)物變化特征基本上與長(zhǎng)焰煤組相似，但之間仍有差異，焦煤試驗(yàn)組第10天，代謝產(chǎn)物中芳香環(huán)和雜環(huán)化合物分子量相對(duì)較小，原因是在排除微生物降解發(fā)酵底物的可能性條件下，焦煤較長(zhǎng)焰煤變質(zhì)程度大，不易被微生物降解，得到的長(zhǎng)鏈烷烴分子量相對(duì)較小。在發(fā)酵第15天同時(shí)又有大分子物質(zhì)產(chǎn)生，如正二十一烷(10號(hào)峰)、正三十烷(13號(hào)峰)，并且十九烯(12號(hào)峰)豐度增長(zhǎng)較大，較長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組，新生成的長(zhǎng)鏈烷烴分子量較大，表明微生物已經(jīng)對(duì)焦煤進(jìn)行降解(表3)。

表3 焦煤厭氧發(fā)酵過(guò)程中GC-MS半定性結(jié)果

瘦煤發(fā)酵過(guò)程液相產(chǎn)物變化特征較長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組、焦煤試驗(yàn)組有所不同，同樣易揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和甲基化合物等物質(zhì)(丁酸、苯酚、4-甲基戊酸、2-甲基丁酸)在第10天的豐度有所升高(圖4、表4)，但從以后的樣品GC-MS測(cè)試結(jié)果來(lái)看，部分VFA從生成就無(wú)法被充分利用，說(shuō)明在瘦煤的煤制甲烷試驗(yàn)過(guò)程中菌群活性較長(zhǎng)焰煤與焦煤試驗(yàn)組的要低，從而使得VFA的降解速率小于生成速率，這也是瘦煤試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷量低的原因之一。

表4 瘦煤生物制氣發(fā)酵液GC-MS半定性結(jié)果

前人研究結(jié)果表明，煤層水中或煤的可有機(jī)提取物中存在長(zhǎng)鏈烷烴、類(lèi)異戊二烯和多種長(zhǎng)鏈脂肪類(lèi)和飽和烴類(lèi)化合物(如本研究的二十四烷、二十五烷、二十一烷等)[29]，同時(shí)在煤層氣井排采水中檢測(cè)到的單甲基烷烴和烷基環(huán)己烷是典型的微生物降解煤的產(chǎn)物[30]，脂肪族化合物和環(huán)狀碳?xì)浠衔锟赡苁敲簩铀猩锝到庵舅岬任镔|(zhì)的結(jié)果[31]。一些研究結(jié)果表明，低成熟度煤中存在低分子量水溶性有機(jī)物，在這些研究中，主要的可提取化合物及其濃度取決于煤的成熟度，一些發(fā)酵中間產(chǎn)物(如脂肪酸)具有潛在毒性或抑制甲烷的生成[32]。甲烷生成的抑制可能與通過(guò)有機(jī)酸中間體的積累降低酸堿度有關(guān)。焦煤試驗(yàn)組檢測(cè)到的脂肪酸(十八酸)豐度較大，可抑制甲烷的生成，這可能是焦煤試驗(yàn)組相較長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組甲烷產(chǎn)量低的原因之一。同時(shí)福莫羅等[29]對(duì)低階煤和高階煤的提取物進(jìn)行的研究表明，在地下煤炭生態(tài)系統(tǒng)中，芳烴的生物降解優(yōu)先于脂肪類(lèi)物質(zhì)。長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組中多環(huán)芳烴及其功能衍生物(如2,4-二叔丁基苯酚)豐度較焦煤試驗(yàn)組(如鄰苯二甲酸二正丁酯)和瘦煤試驗(yàn)組(如苯酚)高的多，更適合微生物降解，產(chǎn)生更多的生物甲烷。

2.3 煤表面菌群吸附特征

為了觀察不同煤階煤發(fā)酵體系中煤樣表面微生物群落和浮游微生物群落的附著規(guī)律，進(jìn)行了掃描電鏡試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。試驗(yàn)依次從3個(gè)階段(第10天、第15天和第20天)概述了菌群的形態(tài)類(lèi)型、附著方法以及煤表面的變化特征。

圖5 不同煤樣厭氧發(fā)酵過(guò)程中煤表面結(jié)構(gòu)變化特征Fig.5 Change characteristics of coal surface structure in process of anaerobic fermentation for different coal samples

第10天，在3種類(lèi)型煤樣表面均觀察到細(xì)胞的存在，但存在的形態(tài)類(lèi)型不同。長(zhǎng)焰煤表面存在球狀細(xì)胞(長(zhǎng)0～0.8 μm)和桿狀細(xì)胞(長(zhǎng)1～2 μm)，但主要以球狀為主。焦煤表面存在棒狀的異型體(長(zhǎng)0～1.2 μm)和桿狀黏附細(xì)胞(長(zhǎng)2～3 μm)，分布較單一，沒(méi)有出現(xiàn)群居分布。瘦煤表面細(xì)胞也由單一球狀(長(zhǎng)0～0.8 μm)結(jié)構(gòu)形態(tài)組成。

第15天，長(zhǎng)焰煤表面觀察到與第10天相同形態(tài)的細(xì)胞，沒(méi)有明顯的附著跡象，但數(shù)量增加，偶爾出現(xiàn)菌絲包裹球狀細(xì)胞的現(xiàn)象。焦煤在第15天棒狀的異型體細(xì)胞密度增加(長(zhǎng)0.8～1.2 μm)，同樣也沒(méi)有明顯的附著跡象。而在瘦煤表面觀察到一種新的形態(tài)(長(zhǎng)2～3 μm)，并對(duì)煤樣的黏附性較大，偶爾與球狀細(xì)胞相互交融。大體在第15天細(xì)胞密度均有所增加，細(xì)菌的活性在10～15 d增長(zhǎng)較快。

在發(fā)酵末期(第20天)，長(zhǎng)焰煤表面細(xì)絲狀形態(tài)明顯，但球狀和桿狀細(xì)胞密度減少。焦煤表面偶爾能觀察到桿狀粘附細(xì)胞，發(fā)酵分泌物分布較大，整體較第15天細(xì)胞密度有所減少。最后，焦煤和瘦煤表面均發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞裂解現(xiàn)象，說(shuō)明在第20天細(xì)菌陸續(xù)死亡，致使發(fā)酵體系開(kāi)始減弱。

觀察不同天數(shù)下煤樣表面的變化特征，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)焰煤表面凹凸不平，粗糙度逐漸增加，側(cè)面反映出長(zhǎng)焰煤被菌群充分降解。而焦煤和瘦煤表面發(fā)酵分泌物增多，但表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，所以相較于長(zhǎng)焰煤，焦煤和瘦煤煤階較高，很難被微生物利用。

一些學(xué)者對(duì)煤層微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了活性監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)相較于煤層水，附著在煤固體上的微生物更多，所以觀察煤表面的菌群分布更能反映煤生物發(fā)酵過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組液相產(chǎn)物中生成的VFA較多，對(duì)發(fā)酵不利的細(xì)菌源Desulfovibrio(脫硫弧菌)和Pseudomonas(假單胞菌)菌為桿狀菌[33]，因此球狀菌可能是對(duì)發(fā)酵有利的水解菌與乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，它們較高的吸附率驗(yàn)證了長(zhǎng)煙煤組產(chǎn)甲烷量高的事實(shí)[34]，所以在長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組觀察到的菌群分布多為球狀菌。發(fā)酵過(guò)程中CO2生成量與液相產(chǎn)物分子量成正比關(guān)系這一結(jié)論已被證實(shí)，并且焦煤試驗(yàn)組生物降解焦煤產(chǎn)生的甲基類(lèi)物質(zhì)和大分子脂肪烴物質(zhì)豐度較大，因此在焦煤試驗(yàn)組中可能以還原CO2為代謝途徑的Methanobacterium(甲烷桿菌屬)[35]含量較多，與圖5焦煤試驗(yàn)組SEM圖像相匹配。瘦煤試驗(yàn)組甲基類(lèi)物質(zhì)與VFA含量較豐富，因此與長(zhǎng)煙煤組電鏡結(jié)果相似，以球狀菌為主，也可能存在以還原CO2為代謝途徑的Methanobacterium，但兩者相對(duì)含量較低，與瘦煤試驗(yàn)組SEM測(cè)試結(jié)果相符，甲烷產(chǎn)量相對(duì)較低。由此可以看出，液相產(chǎn)物可以間接表征煤樣表面菌群的吸附特征，為煤制生物甲烷過(guò)程中微生物的分布特征研究提供借鑒。

3 結(jié) 論

1)生物產(chǎn)氣總量與煤階成反比，煤階越高，生物產(chǎn)氣總量越低，并且低煤階煤的生物甲烷產(chǎn)量明顯高于高煤價(jià)煤，說(shuō)明低階煤更適合作為碳源供產(chǎn)甲烷菌利用。

2)3個(gè)煤階的煤生物產(chǎn)氣過(guò)程的第10天有VFA和甲基化合物等物質(zhì)生成，長(zhǎng)焰煤試驗(yàn)組與焦煤試驗(yàn)組在產(chǎn)氣高峰期(第15天)未檢測(cè)到VFA等小分子物質(zhì)存在，并且伴隨有新的大分子物質(zhì)生成，而瘦煤試驗(yàn)組并未在第15天檢測(cè)到VFA，可能歸因于瘦煤試驗(yàn)組發(fā)酵后期產(chǎn)甲烷菌活性的降低。

3)液相產(chǎn)物可以間接表征煤樣表面菌群的吸附特征。在發(fā)酵第10天，均檢測(cè)到菌群細(xì)胞的存在，但存在的形態(tài)類(lèi)型不同；在發(fā)酵第15天，細(xì)胞密度均有所增加；在發(fā)酵第20天，長(zhǎng)焰煤表面球狀和桿狀細(xì)胞密度減少，焦煤和瘦煤表面發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞裂解現(xiàn)象。

4)長(zhǎng)焰煤表面凹凸不平，粗糙度逐漸增加，而焦煤和瘦煤表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。