ACTN4通過(guò)靶向NDUFV1對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖的影響

馮 成，程曉敏，謝一清，康利平，孫璋然，范 旭，耿慧武，劉曉穎

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率居高不下，急需有效的診斷和治療手段。α-輔肌動(dòng)蛋白(alpha-actinins, ACTNs)定位于細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的接觸部位，通過(guò)將膜受體與細(xì)胞骨架相連來(lái)調(diào)節(jié)不同信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。α-輔肌動(dòng)蛋白家族有四個(gè)成員，α-輔肌動(dòng)蛋白-4(alpha-actinin-4, ACTN4)作為成員之一，在細(xì)胞中的分布廣泛，并能夠參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)等[2-3]。同時(shí)，在細(xì) 胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中ACTN4也發(fā)揮著重要作用，如參與核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Wnt / β-catenin等多種信號(hào)通路的調(diào)控[4-5]。在肝癌細(xì)胞中，ACTN4能夠調(diào)控AKT/mTOR通路促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[6]。ACTN4已經(jīng)被證實(shí)可以通過(guò)影響NF-κB的活性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。該研究在ESCC中探究ACTN4的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1試劑與抗體 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM(高糖)培養(yǎng)基和Opti-MEM購(gòu)于美國(guó)GE公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)CLARK Bioscience公司；胰酶消化液購(gòu)于德國(guó)Bio-Froxx公司；Lipofectamine RNAiMAX和Lipofectamine 2000試劑購(gòu)于美國(guó)Thermo-Fisher公司；一抗稀釋液、青鏈霉素溶液、Western及IP細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二甲亞砜(DMSO)購(gòu)于德國(guó)Sigma-Aldrich公司；ACTN4、NADH ∶泛素氧化還原酶核心亞基V1(NADH ∶ubiquinone oxidoreductase core subunit V1, NDUFV1)和β-actin抗體購(gòu)于武漢Proteintech公司。

1.1.2主要儀器 BSC-2級(jí)生物安全柜(1300 SERIES A2)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(VIOS160i)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；倒置光學(xué)顯微鏡(TS-100，日本尼康公司)；倒置熒光顯微鏡(Dmil LED，德國(guó)Leica公司)；高速冷凍離心機(jī)(Allegra 30r，美國(guó)Beckman Coulter公司)；恒壓電泳儀(PowerPac Basic，美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.1.3shRNA ACTN4 shRNA質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，序列見(jiàn)表1。

表1 針對(duì)ACTN4的shRNA序列

1.1.4組織和細(xì)胞 91例食管鱗狀細(xì)胞癌組織于2016—2017年分批取自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普胸外科，經(jīng)胸腹腔鏡根治術(shù)切除的食管組織，在確保病理檢測(cè)的前提下切取小部分組織分別保存于-80 ℃及福爾馬林固定、包埋。所有患者于術(shù)前已閱讀并簽署“組織取材知情同意書”，并上報(bào)所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理部備案。食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞ECA109和人胚胎腎細(xì)胞HEK 293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫組化實(shí)驗(yàn) 選取91例ESCC的組織芯片梯度復(fù)溫；將組織芯片置于45 ℃二甲苯溶液中脫蠟25 min，重復(fù)1次；將組織芯片依次放入100%乙醇10 min，100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，85%乙醇3 min，75%乙醇3 min，雙蒸水1中3 min，雙蒸水2中3 min，梯度脫蠟至水；3% H2O2去除內(nèi)源過(guò)氧化氫酶30 min，PBS清洗3次；1%脫脂牛奶封閉30 min；4 ℃孵育一抗過(guò)夜，次日PBS清洗3次；室溫孵育二抗30 min，PBS清洗3次；DAB溶液顯色(時(shí)間根據(jù)情況而定)，雙蒸水終止反應(yīng)；蘇木精溶液染核1 min，雙蒸水清洗，烘干后封片，鏡下觀察并委托武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司進(jìn)行掃描。

1.2.2免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果打分細(xì)則 對(duì)TMA芯片掃描結(jié)果進(jìn)行打分，根據(jù)組織的染色強(qiáng)度和染色數(shù)目不同，將染色強(qiáng)度分為弱染色、中等染色和強(qiáng)染色三個(gè)等級(jí)，分別計(jì)為1～3分；將染色數(shù)目分為0～25%，26%～50%，51%～75%，76%～100%四個(gè)等級(jí)，分別計(jì)為1～4分。將二者相乘可得ACTN4在組織中的相對(duì)表達(dá)量得分。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) ECA109細(xì)胞使用含8%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，HEK 293T細(xì)胞使用含8%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)；培養(yǎng)的細(xì)胞每2 d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度大于90%時(shí)進(jìn)行傳代，使用胰酶消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，用培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)并計(jì)數(shù)。

1.2.4shRNA敲低實(shí)驗(yàn) 將HEK 293T細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的數(shù)量接種到6孔板。次日觀察細(xì)胞狀態(tài)及匯合度合適即可進(jìn)行慢病毒包裝，將 shACTN4-1/shACTN4-2/ pLKO.1(空載)、Rev、GAG和VSVG按2 ∶2 ∶2 ∶1的比例用Opti-MEM混合；再以1 ∶1的比例稀釋Lipofectamine 2000試劑，將二者混合靜置15 min；棄去6孔板中的培養(yǎng)基，加入上述混合液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；將ECA109細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的數(shù)量接種到6孔板。第3日觀察ECA109細(xì)胞狀態(tài)及匯合度；HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)到24 h時(shí)，收取培養(yǎng)基離心保留上清液；棄盡ECA109細(xì)胞6孔板中的培養(yǎng)基，加入上述上清液并標(biāo)記為4組：①未處理組(正常培養(yǎng)基)；②pLKO.1組(陰性對(duì)照，pLKO.1慢病毒顆粒感染)；③shACTN4-1組(shACTN4-1慢病毒顆粒感染)；④shACTN4-2組(shACTN4-2慢病毒顆粒感染)。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，可通過(guò)熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率；若感染效率良好，則將細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并用嘌呤霉素(4 μg/ml)藥篩2 d，之后梯度降低嘌呤霉素濃度繼續(xù)藥篩，1周后檢測(cè)shRNA敲低效果。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 加入適量Western及IP細(xì)胞裂解液(含1% PMSF)裂解細(xì)胞，冰上靜置30～40 min；4 ℃、14 000 r/min離心20 min；轉(zhuǎn)移上清液，Bradfrod法測(cè)定蛋白濃度；樣品加入上樣緩沖液沸水浴5～10 min，每個(gè)樣品取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST清洗3次，每次10 min；孵育一抗4 ℃過(guò)夜，次日TBST清洗3次；再室溫孵育二抗1.5 h，TBST清洗3次；顯影。

1.2.6細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 按照步驟1.2.4中進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后48 h胰酶消化細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照1 000～2 000個(gè)/每孔將細(xì)胞接種到新的6孔板進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，每3 d更換培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)10 d后，觀察單個(gè)克隆直徑達(dá)到1 mm取出6孔板棄盡培養(yǎng)基，PBS清洗2次，預(yù)冷的70%甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，流動(dòng)水洗去浮色，烘干后拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有計(jì)量資料取小數(shù)點(diǎn)后3位并用表示，使用t檢驗(yàn)分析兩組結(jié)果之間的差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)性分析采用斯皮爾曼相關(guān)(Spearman)系數(shù)法進(jìn)行分析，依據(jù)兩列成對(duì)等級(jí)的各對(duì)等級(jí)數(shù)之差來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，相關(guān)系數(shù)用ρ表示。

2 結(jié)果

2.1 ACTN4在ESCC組織中表達(dá)情況ESCC組織與正常食管上皮組織交替排列(n=91)(圖1A)，在ESCC組織中ACTN4呈現(xiàn)普遍的特異性高表達(dá)，且主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)；在正常食管上皮組織中ACTN4同樣在細(xì)胞質(zhì)中存在，但表達(dá)量較低，并且隨著食管上皮繼續(xù)向表層分化，ACTN4的表達(dá)量逐漸減少(圖1B)。TMA芯片打分結(jié)果顯示ESCC組織中ACTN4的表達(dá)量高于正常食管上皮組織，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。進(jìn)一步通過(guò)Spearman相關(guān)系數(shù)對(duì)打分結(jié)果和病例的病理信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)，結(jié)果顯示ACTN4的表達(dá)與ESCC病例中臨床病理特征均無(wú)相關(guān)性，但ACTN4在ESCC組織中的表達(dá)量高于正常食管上皮組織。據(jù)此推測(cè)ACTN4在ESCC中的表達(dá)上調(diào)是一個(gè)早期事件。

圖1 IHC法檢測(cè)ESCC組織中ACTN4的表達(dá)A：TMA組織芯片掃描圖；B：ESCC組織和正常食管上皮組織ACTN4 DAB顯色結(jié)果；C：TMA組織芯片IHC結(jié)果打分柱狀圖；1：ESCC組織；2：正常食管上皮組織；與正常食管上皮組織比較：****P<0.000 1

表2 TMA芯片打分和病理資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.2 ACTN4穩(wěn)定低表達(dá)ECA109細(xì)胞株的構(gòu)建熒光顯微鏡觀察慢病毒的感染效率，如圖2A所示，綠色熒光占比可達(dá)約85%，表明ACTN4 shRNA慢病毒良好的感染效率。經(jīng)過(guò)嘌呤霉素藥篩后，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度90%～95%時(shí)收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示shRNA敲低組相比于陰性對(duì)照組(pLKO.1)ACTN4的蛋白水平降低(圖2B)。該結(jié)果表明，ACTN4穩(wěn)定低表達(dá)的ECA109細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖2 ACTN4穩(wěn)定低表達(dá)的ECA109細(xì)胞株的構(gòu)建A：ECA109細(xì)胞感染ACTN4 shRNA慢病毒質(zhì)粒48 h的感染效率圖；BF：自然光；GFP：綠色熒光；B：ECA109細(xì)胞感染ACTN4 shRNA慢病毒質(zhì)粒嘌呤霉素藥篩后蛋白表達(dá)；1：pLKO.1組(陰性對(duì)照)；2：shACTN4-1組；3：shACTN4-2組；4：未處理組

2.3 ACTN4 shRNA敲低對(duì)ECA109的細(xì)胞增殖的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于陰性對(duì)照組，ACTN4 shRNA敲低組克隆的數(shù)量和大小都有明顯降低(圖3)。該結(jié)果提示，敲低ACTN4抑制了ESCC細(xì)胞的增殖，即ACTN4能夠促進(jìn)ESCC的細(xì)胞增殖。

圖3 ACTN4穩(wěn)定低表達(dá)ECA109細(xì)胞克隆形成染色結(jié)果1：pLKO.1組(陰性對(duì)照)；2：shACTN4-1組；3：shACTN4-2組

2.4 ACTN4 shRNA敲低對(duì)NDUFV1蛋白表達(dá)的影響利用之前構(gòu)建的ACTN4穩(wěn)定低表達(dá)ECA109細(xì)胞株進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示，ACTN4敲低的ECA109細(xì)胞中NDUFV1蛋白水平降低。見(jiàn)圖4。

圖4 ACTN4 shRNA敲低下調(diào)NDUFV1蛋白表達(dá)1：pLKO.1組(陰性對(duì)照)；2：shACTN4-1組；3：shACTN4-2組

3 討論

癌癥是威脅人類健康的主要?dú)⑹?，食管鱗狀細(xì)胞癌作為病死率極高的癌癥，深入研究其發(fā)生發(fā)展并尋找有效的診斷和治療手段非常必要。ACTN4屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族，最初被認(rèn)為是一種與癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的非肌肉型α-肌動(dòng)蛋白。ACTN4具有許多不同功能，如參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建、調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子的活性及病毒的復(fù)制等[7-8]。研究顯示，在多種腫瘤中ACTN4表達(dá)升高：在唾液腺癌和舌癌中發(fā)現(xiàn)其基因拷貝數(shù)存在異常，且其基因所在的染色體19q區(qū)域發(fā)生了異常擴(kuò)增[9]；在結(jié)直腸癌和肺癌中ACTN4呈現(xiàn)高表達(dá)且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性[10]。ACTN4基因可能作為促癌因子參與某些腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞周期調(diào)控。研究[11]顯示，ACTN4能夠與遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1(FUBP1)相互作用調(diào)節(jié)原癌基因MYC的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展；ACTN4已經(jīng)被證實(shí)與EMT密切相關(guān)，能夠調(diào)控NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)EMT的激活和發(fā)展，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本課題組前期研究[12]表明，在黑色素瘤中ACTN4可以參與調(diào)節(jié)受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)的穩(wěn)定性并激活NF-κB從而促進(jìn)黑色素瘤的細(xì)胞增殖。這些研究表明ACTN4在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的重要性。本研究結(jié)果顯示ACTN4在ESCC組織中表達(dá)上調(diào)，但其表達(dá)與目前掌握的病理資料中的臨床病理特征無(wú)相關(guān)性；shRNA技術(shù)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ACTN4敲低抑制ESCC細(xì)胞的克隆形成能力，即ACTN4能夠促進(jìn)ESCC的細(xì)胞增殖。表明在ESCC發(fā)生的早期ACTN4就發(fā)生了高表達(dá)并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖促進(jìn)ESCC的發(fā)展，且一直持續(xù)到惡性階段，提示ACTN4作為ESCC早期診斷的預(yù)測(cè)標(biāo)志物的可能；ACTN4促進(jìn)細(xì)胞增殖的具體機(jī)制仍待探究。值得注意的是多項(xiàng)研究[13-14]表明ACTN4可影響細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力，從而影響其生物學(xué)行為，進(jìn)一步表明ACTN4可能為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。

研究顯示，NDUFV1能夠參與線粒體呼吸鏈氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量的過(guò)程，NDUFV1的缺陷是線粒體功能障礙的常見(jiàn)原因，且與肌病、腦肌病和神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病和利氏綜合征)有關(guān)[15]；在肺癌細(xì)胞中敲除NDUFV1，細(xì)胞的存活和耐藥能力顯著降低[16]。本研究表明，在ESCC細(xì)胞中ACTN4敲低抑制了NDUFV1的蛋白表達(dá)。由此推測(cè)，ACTN4敲低所致的NDUFV1表達(dá)降低可能導(dǎo)致ESCC細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙，從而抑制ESCC細(xì)胞的增殖。這為進(jìn)一步探究ACTN4在ESCC中的具體分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

ACTN4參與了不同信號(hào)通路的調(diào)控，且越來(lái)越多的ACTN4相互作用蛋白被發(fā)現(xiàn)，豐富了ACTN4在腫瘤中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及作用機(jī)制研究，推動(dòng)了以ACTN4為靶點(diǎn)的抗癌化合物的研發(fā)。如鞣花酸能夠破壞ACTN4與β-catenin的相互作用從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[17]?；诓煌[瘤存在異質(zhì)性及化療藥物存在毒副反應(yīng)等問(wèn)題，以及ACTN4可否作為腫瘤治療的靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探究。