恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的應(yīng)用價(jià)值

李靜 吳哲淵 楊景卉 楊麗媛 王莉莉 袁鋒 沈鑫 江淵

如何在新型冠狀病毒肺炎大流行的背景下做好結(jié)核病防控工作，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)提出了一系列的建議[1]，其中包括如何提高實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)陽(yáng)性率和快速檢測(cè)能力。傳統(tǒng)的痰涂片鏡檢法檢測(cè)敏感度較低，培養(yǎng)法雖然敏感度較高但其檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)且需要進(jìn)一步鑒定區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)和非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，兩種方法均無(wú)法滿(mǎn)足臨床早期發(fā)現(xiàn)和診斷結(jié)核病的需求。近年來(lái)，越來(lái)越多的以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)診斷結(jié)核病的檢測(cè)技術(shù)被WHO推薦[2]。恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法是一種新型的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，不依賴(lài)溫度循環(huán)變化，只需恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)。其操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，可直接檢測(cè)臨床樣本中的MTBC。本研究選擇上海市6家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院為研究現(xiàn)場(chǎng)，收集疑似肺結(jié)核患者痰樣本進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法與傳統(tǒng)的痰涂片、BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱(chēng)“液體培養(yǎng)”)及GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱(chēng)“GeneXpert”)檢測(cè)。以液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，比較恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法與痰涂片及GeneXpert的檢測(cè)效能，評(píng)價(jià)恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)痰樣本中MTBC的臨床應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

選擇上海市6家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院(上海市肺科醫(yī)院、上海市松江區(qū)中心醫(yī)院、上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院、上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院、上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院、中國(guó)人民解放軍905醫(yī)院)作為研究現(xiàn)場(chǎng)，連續(xù)納入2020年1月至2020年11月各家醫(yī)院肺科門(mén)診初診的疑似肺結(jié)核患者。共納入和收集2014例疑似肺結(jié)核患者痰樣本，對(duì)收集到的痰樣本進(jìn)行痰涂片、液體培養(yǎng)、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法和GeneXpert四種方法檢測(cè)。去除59例重復(fù)樣本、43例無(wú)明確臨床診斷者、64例培養(yǎng)污染等無(wú)效結(jié)果，最終1848例患者納入研究。本研究通過(guò)上海市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理號(hào)：2020-12 快速高通量分子診斷技術(shù)在上海示范區(qū)的驗(yàn)證推廣研究)。

二、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)按照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[3]及《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008年版)》[4]中規(guī)定的咳嗽、咳痰≥2周，或痰中帶血或咯血等的肺結(jié)核疑似癥狀者；(2)同意留取痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，且留取的痰標(biāo)本量不少于3.0 ml者。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不同意參加本研究項(xiàng)目者；(2)未同時(shí)進(jìn)行4種方法檢測(cè)者；(3)檢測(cè)期間，任一方法未獲得有效檢測(cè)結(jié)果者。

三、儀器與試劑

BACTEC MGIT 960 全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)儀、MGIT 7 ml培養(yǎng)管和分枝桿菌培養(yǎng)添加試劑盒均購(gòu)自于美國(guó)BD公司；GeneXpert MTB/RIF儀器及檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司；抗酸染色試劑購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；結(jié)核分枝桿菌MPT64抗原購(gòu)自韓國(guó)Standard Diagnostics公司；Deaou-308C 恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀和MTBC核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州迪澳生物科技有限公司。以上試劑均由上海市疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)一招標(biāo)采購(gòu)發(fā)放至6個(gè)研究現(xiàn)場(chǎng)。

四、方法

1.標(biāo)本采集：按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]要求收集痰樣本，每例患者收集3份痰樣本(即時(shí)痰、夜間痰、晨痰)，混勻后分別進(jìn)行痰涂片、液體培養(yǎng)、GeneXpert檢測(cè)、恒溫?cái)U(kuò)增熒光法檢測(cè)。

2.痰涂片：按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[6]中的標(biāo)準(zhǔn)操作程序執(zhí)行，采用直接涂片法。5家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院、上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院、上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院、上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院、中國(guó)人民解放軍905醫(yī)院)采用萋-尼抗酸染色；上海市肺科醫(yī)院采用熒光抗酸染色。

3.液體培養(yǎng)：采用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法進(jìn)行痰樣本前處理，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]進(jìn)行操作。培養(yǎng)42 d儀器未報(bào)陽(yáng)，報(bào)告液體培養(yǎng)陰性；對(duì)儀器報(bào)陽(yáng)的培養(yǎng)物經(jīng)涂片抗酸染色確認(rèn)后，采用結(jié)核分枝桿菌抗原MPT64檢測(cè)(膠體金法)進(jìn)行MTBC和NTM初步鑒定。排除初步鑒定為陰性且臨床診斷為非肺結(jié)核者；對(duì)于初步鑒定為陰性且臨床診斷為肺結(jié)核者，進(jìn)一步采用16S rRNA 測(cè)序方法進(jìn)行菌種鑒定。

4.GeneXpert檢測(cè)：按照操作說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行，通過(guò)專(zhuān)用軟件判讀結(jié)果。

5.恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法：采用廣州迪澳生物科技有限公司生產(chǎn)的MTBC核酸檢測(cè)試劑盒，按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和結(jié)果判讀。即以出峰時(shí)間和熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)顯示結(jié)果。出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)為陽(yáng)性(含有 MTBC)，無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)為陰性。

五、相關(guān)指標(biāo)計(jì)算

敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/患者總例數(shù)×100%。

六、質(zhì)量控制

為保證多中心評(píng)估質(zhì)量，項(xiàng)目啟動(dòng)前上海市疾病預(yù)防控制中心對(duì)6家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院技術(shù)人員開(kāi)展了項(xiàng)目培訓(xùn)，明確病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)、痰標(biāo)本收集及檢測(cè)要求，并對(duì)恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法開(kāi)展技術(shù)培訓(xùn)；項(xiàng)目開(kāi)展期間，上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室定期對(duì)6家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展質(zhì)控與督導(dǎo)。痰涂片質(zhì)量控制包括室內(nèi)質(zhì)控(內(nèi)容包括采用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、設(shè)備耗材、痰標(biāo)本收集、涂片制備、染色、鏡檢、痰涂片保存等過(guò)程的內(nèi)部檢查和監(jiān)測(cè))和室間質(zhì)控(參加上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的盲法復(fù)檢及上海市臨床檢驗(yàn)中心組織的痰涂片抗酸染色室間比對(duì))，成績(jī)均達(dá)標(biāo)。培養(yǎng)的質(zhì)量控制包括對(duì)使用的培養(yǎng)管及相關(guān)試劑盒質(zhì)控、實(shí)驗(yàn)物品(標(biāo)本瓶、稀釋管、接種物品等)質(zhì)控和污染控制等。6家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院參加由國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的分子能力驗(yàn)證室間比對(duì)，GeneXpert和恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法成績(jī)均合格。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4種不同檢測(cè)方法檢出率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；以液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、痰涂片、GeneXpert檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和95%CI值；一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75說(shuō)明一致性好，Kappa值<0.40說(shuō)明一致性較差，0.40≤Kappa值<0.75說(shuō)明一致性一般。

結(jié) 果

一、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法與痰涂片、液體培養(yǎng)和GeneXpert的檢出率結(jié)果比較

在1848例患者痰樣本中，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、痰涂片、液體培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)MTBC的檢出率分別為16.7%(309/1848)、14.4%(266/1848)、25.4%(470/1848)和28.7%(530/1848)。恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢出率(16.7%)低于液體培養(yǎng)(25.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.16，P=0.001)，也低于GeneXpert檢測(cè)結(jié)果(28.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=75.31，P=0.001)。

二、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法與痰涂片、GeneXpert檢測(cè)效能分析

以液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、痰涂片和GeneXpert檢測(cè)的敏感度分別為58.94%(95%CI:54.33%～63.40%)、52.77%(95%CI: 48.14%～57.34%)、80.43%(95%CI: 76.49%～83.86%)；特異度分別為97.68%(95%CI:96.70%～98.38%)、98.69%(95%CI:97.90%～99.20%)、88.97%(95%CI:87.17%～90.55%)。見(jiàn)表1。以液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、痰涂片和GeneXpert檢測(cè)的一致率分別為87.82%(1623/1848)、87.01%(1608/1848)、86.80%(1604/1848)，Kappa值分別為0.638、0.600、0.666，說(shuō)明3種檢測(cè)方法與液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果一致性均一般。

表1 以液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、痰涂片和GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)效能分析

三、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法與痰涂片、液體培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)不同性狀痰樣本的結(jié)果分析

本研究對(duì)收集到的817例臨床診斷肺結(jié)核患者的不同性狀痰樣本(黏液樣痰、唾液樣痰、干酪樣痰和血樣痰)進(jìn)行4種方法檢測(cè)結(jié)果比較。結(jié)果顯示，采用同一種檢測(cè)方法檢測(cè)4種不同性狀痰樣本，干酪樣痰的檢出率均明顯高于唾液樣痰，除液體培養(yǎng)(χ2=1.700，P=0.193)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3種檢測(cè)方法(恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、痰涂片和GeneXpert)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.140，P=0.004；χ2=5.840，P=0.016；χ2=14.950，P=0.001)。在4種不同性狀痰樣本中，除在唾液樣痰中液體培養(yǎng)檢出率最高[38.8%(59/152)]外，其余3種性狀痰樣本(黏液樣痰、干酪樣痰和血樣痰)均為GeneXpert檢出率最高，分別為51.5%(308/598)、66.7%(28/42)和64.0%(16/25)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)817例臨床診斷肺結(jié)核患者的不同性狀痰樣本進(jìn)行4種方法檢測(cè)的結(jié)果

四、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法和GeneXpert檢測(cè)結(jié)果與痰涂片分級(jí)的比較

根據(jù)痰涂片級(jí)別，可分為6個(gè)級(jí)別(陰性～4+)。817例臨床診斷肺結(jié)核患者中，有583例(71.4%)涂陰患者。在涂陰樣本中，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法的檢出率為10.3%(60/583)，低于GeneXpert檢測(cè)的31.9%(186/583)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=81.790，P=0.001)。各檢測(cè)方法的檢出率隨著涂片陽(yáng)性級(jí)別增高而升高；低級(jí)別陽(yáng)性(條數(shù)～1+)的樣本中，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢出率為75.5%(105/139)，GeneXpert檢出率為92.1%(128/139)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.030，P=0.001)；中高級(jí)別(2+～4+)樣本中的二種檢測(cè)方法檢出率均較高，分別為94.7%(90/95)和93.7%(89/95)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.100，P=0.756)。在420例臨床診斷肺結(jié)核患者的涂陰培陰患者中，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢出率為4.5%(19/420),低于GeneXpert檢出率[19.8%(83/420)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.710，P=0.001)。見(jiàn)表3。

表3 817例臨床診斷肺結(jié)核患者的痰涂片分級(jí)與恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、GeneXpert檢測(cè)結(jié)果的比較

討 論

近年來(lái)，結(jié)核病新診斷技術(shù)的研發(fā)取得了顯著的進(jìn)展[7]。WHO推薦了包括多色半巢式熒光定量 PCR、微流體芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法等若干新型結(jié)核病診斷新技術(shù)[8]。恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法是一種將恒溫?cái)U(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光技術(shù)相結(jié)合的新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是“十二五”期間我國(guó)自主研發(fā)的結(jié)核病分子生物學(xué)快速診斷技術(shù)，前期已有應(yīng)用該技術(shù)對(duì)結(jié)核病患者的臨床樣本進(jìn)行快速診斷和評(píng)估的報(bào)道[9]。本研究是“十三五”期間我中心承擔(dān)的該技術(shù)多中心評(píng)估項(xiàng)目，研究結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法的敏感度(58.94%)高于痰涂片(52.77%)，但低于GeneXpert檢測(cè)(80.43%)，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法的特異度(97.68%)與痰涂片(98.69%)相當(dāng)，高于GeneXpert檢測(cè)(88.97%)；一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法、痰涂片和GeneXpert與液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果一致性均一般。

馬曉光等[9]研究結(jié)果顯示，恒溫?cái)U(kuò)增熒光法檢出率為17.14%，高于痰涂片(8.12%)和培養(yǎng)法(13.47%)；楊健等[10]報(bào)道環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)陽(yáng)性檢出率(51.55%)明顯高于痰涂片鏡檢法(31.40%)和固體培養(yǎng)法(39.92%)。本研究中應(yīng)用恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)MTBC的檢出率為16.7%，相比痰涂片(14.4%)檢出率略有提高，但低于液體培養(yǎng)檢出率(25.4%)，此結(jié)果與國(guó)內(nèi)報(bào)道有所不同[9-11]，原因可能為國(guó)內(nèi)多采用固體培養(yǎng)法或與各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)差異有關(guān)，液體培養(yǎng)法檢測(cè)敏感度高于固體培養(yǎng)，尤其是在含菌量較低的涂陰患者中[12]。檢測(cè)時(shí)間方面，液體培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)時(shí)間雖短于固體培養(yǎng)，但還需平均11 d左右[12]，而恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)時(shí)間僅需要1.5 h左右，大大縮短了臨床診斷肺結(jié)核的時(shí)間；且相比傳統(tǒng)檢測(cè)方法還需進(jìn)一步做菌種鑒定試驗(yàn)。恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法是以MTBC種特異基因IS6110特異性區(qū)域作為檢測(cè)靶標(biāo)，結(jié)果陽(yáng)性即為檢出MTBC。李金莉等[13]報(bào)道采用該方法對(duì)NTM標(biāo)準(zhǔn)株和其他臨床常見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng)，且其檢測(cè)特異度高達(dá)100%。本研究中恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)MTBC 的特異度(97.68%)略低，但與國(guó)內(nèi)其他研究結(jié)果(93.64%～98.02%)一致[9-11]，顯示了其良好的檢測(cè)特異度。恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法與液體培養(yǎng)結(jié)果比較，一致率為87.82%，與痰涂片(87.01%)和GeneXpert(86.80%)檢測(cè)一致率相當(dāng)。

本研究中對(duì)817例臨床診斷肺結(jié)核患者的不同性狀痰樣本的檢出率進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液樣痰的檢出率明顯低于其他3種性狀痰。近些年，隨著肺結(jié)核知識(shí)公眾知曉率的提高，以及居民健康體檢的普及，新診斷肺結(jié)核患者中因典型的結(jié)核病臨床表現(xiàn)就診的患者比例較前減少，多數(shù)就診的疑似肺結(jié)核患者尚處于病程早期，患者痰量少或送檢唾液樣痰。唾液樣痰不是從肺深部咳出，含病原菌量較少而直接影響檢測(cè)MTBC效能，這提示醫(yī)務(wù)人員應(yīng)積極向患者進(jìn)行留痰宣教，講解留痰的重要性，指導(dǎo)患者如何留取肺部深處咳痰，也可采用霧化誘導(dǎo)留痰[14]等人工干預(yù)方式獲得質(zhì)量較好的痰樣，從而提高痰標(biāo)本中MTBC檢出率。有研究表明，血液中含有血紅蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等成分會(huì)抑制PCR反應(yīng)而可能造成分子診斷方法檢測(cè)MTBC檢出率降低[15]。本研究中，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)血樣痰的檢出率(36.0%)明顯低于液體培養(yǎng)(60.0%)和GeneXpert(64.0%)，血樣痰對(duì)恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法的檢出率影響大于GeneXpert。本研究中血樣痰樣本量較少，無(wú)法證明是否是因兩種分子檢測(cè)方法采用的前處理方式或擴(kuò)增方法不同所導(dǎo)致，可在今后工作中做進(jìn)一步探討。對(duì)恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法和GeneXpert檢測(cè)MTBC結(jié)果與痰涂片分級(jí)比較，發(fā)現(xiàn)2種檢測(cè)方法在中高級(jí)別涂陽(yáng)患者中均具有良好的敏感度，但在涂陰培陰患者中，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法的檢出率僅4.5%，低于國(guó)內(nèi)報(bào)道恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法對(duì)涂陰培陰患者10%～20%的檢出率的結(jié)果[10,13]，這可能與采用液體培養(yǎng)提高了培養(yǎng)陽(yáng)性率，從而減少了涂陰培陰患者比例有關(guān)，同時(shí)也表明恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法還需進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系，以提高對(duì)涂陰患者及低級(jí)別涂陽(yáng)患者的檢出率。

恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法是2012年前完成了試劑盒研發(fā)、成果臨床轉(zhuǎn)化和臨床驗(yàn)證評(píng)估[16]，該方法最初是由人工肉眼觀察進(jìn)行結(jié)果判讀，經(jīng)技術(shù)革新，現(xiàn)在恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法應(yīng)用熒光檢測(cè)儀自動(dòng)判讀，實(shí)現(xiàn)了MTBC的快速核酸擴(kuò)增和自動(dòng)化結(jié)果報(bào)告，顯示了該方法自動(dòng)化程度的提高。本研究分別在6個(gè)研究現(xiàn)場(chǎng)開(kāi)展工作，采用熒光檢測(cè)儀自動(dòng)判讀，避免了在不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、操作人員的技術(shù)水平和熟練度等差異而導(dǎo)致人工主觀判讀的誤差，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。本研究結(jié)果顯示，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)MTBC效能相比痰涂片有所提高，但該方法的檢測(cè)敏感度低于GeneXpert。有研究顯示，采用這兩種分子診斷技術(shù)檢測(cè)MTBC均能提高病原學(xué)陽(yáng)性率[17]。雖然恒溫?cái)U(kuò)增熒光法的檢測(cè)敏感度低于GeneXpert，但是，首先該方法使用的是我國(guó)自主研發(fā)的國(guó)產(chǎn)試劑盒，價(jià)格相較美國(guó)生產(chǎn)的GeneXpert試劑盒低很多，近兩年GeneXpert試劑價(jià)格呈現(xiàn)逐年上漲趨勢(shì)，也增加了政府公共衛(wèi)生預(yù)算；其次，國(guó)產(chǎn)試劑亦不會(huì)出現(xiàn)因運(yùn)輸或者試劑報(bào)關(guān)等造成到貨時(shí)間延遲而導(dǎo)致試劑有效期短或可能出現(xiàn)試劑失效等情況；第三，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法所使用的儀器設(shè)備均整合在一個(gè)拉桿箱中，如發(fā)生突發(fā)公共衛(wèi)生事件可攜帶至現(xiàn)場(chǎng)開(kāi)展應(yīng)急檢測(cè)。

恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單、快速，相比傳統(tǒng)PCR方法沒(méi)有較復(fù)雜和嚴(yán)格的技術(shù)要求，但該方法仍屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。有研究表明，該方法的實(shí)驗(yàn)室交叉污染較低，但仍須在四分區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作[18]。隨著《結(jié)核病分級(jí)診療和綜合防治服務(wù)模式試點(diǎn)工作》及《遏制結(jié)核病行動(dòng)計(jì)劃(2019—2022年)》任務(wù)推進(jìn)，我國(guó)正在大力加強(qiáng)對(duì)各地基層實(shí)驗(yàn)室能力的建設(shè)，期望結(jié)核病分子快速診斷技術(shù)能得到更廣泛的應(yīng)用。

綜上所述，恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)法檢測(cè)痰樣本中MTBC具有良好的檢測(cè)特異度，該方法和痰涂片及GeneXpert與液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果一致性均一般，臨床可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室硬件條件及患者情況選擇開(kāi)展多種方法聯(lián)合檢測(cè)，以提高肺結(jié)核的病原學(xué)診斷率。

本研究的不足之處：(1)本研究以液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行多種檢測(cè)方法的效能分析，而其他研究大都以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，因此，可能低估了恒溫?cái)U(kuò)增熒光法檢測(cè)MTBC的效能。(2)本研究未將免疫學(xué)檢查納入評(píng)價(jià)。近年來(lái)γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assay，IGRA)已逐漸成為診斷結(jié)核病的重要輔助手段，尤其對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷[18]。《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]也將IGRA增加到免疫學(xué)檢查中，作為鑒別診斷肺結(jié)核的輔助檢查之一。如進(jìn)一步對(duì)病原學(xué)診斷方法聯(lián)合免疫學(xué)檢查進(jìn)行研究，可更科學(xué)精準(zhǔn)地評(píng)價(jià)多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合診斷對(duì)于結(jié)核病從感染到發(fā)病的不同階段，特別是病原學(xué)陰性肺結(jié)核、亞臨床感染及結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的檢測(cè)效能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)李靜：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、起草文章及審閱；吳哲淵：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、獲取研究經(jīng)費(fèi)和行政支持；楊景卉和楊麗媛：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)；王莉莉：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究；袁鋒：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)；沈鑫：獲取研究經(jīng)費(fèi)、行政支持和審閱；江淵：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、行政支持和技術(shù)指導(dǎo)及審閱