調(diào)節(jié)肌紅蛋白結(jié)構(gòu)及肉品色澤的化學(xué)/物理方法及其機(jī)制研究進(jìn)展

柏怡文，柯志剛，周緒霞，丁玉庭*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州，310014) 3(國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連，116034)

色澤是反映肉和肉制品新鮮度和品質(zhì)最直觀的指標(biāo)，直接影響消費(fèi)者的購買意愿，其主要由肌紅蛋白(myoglobin, Mb)中鐵離子的氧化還原狀態(tài)決定。Mb由1條多肽鏈和1個(gè)輔基血紅素組成，在牛肉、豬瘦肉等肌細(xì)胞中大量存在，起著儲(chǔ)存和分配氧的功能，一般有脫氧肌紅蛋白(deoxymyoglobin, DeoMb, MbFe2+)、氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin, OxyMb，MbFe2+O2)和高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin, MetMb，MbFe3+)3種形式，分別呈紫紅色、鮮紅色和棕褐色[1]。在新鮮肉中，Mb主要以O(shè)xyMb形式存在，其中鐵呈+2價(jià)并與O2配位結(jié)合而呈鮮紅色。隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，Mb中的鐵逐漸被氧化成+3價(jià)而轉(zhuǎn)變?yōu)镸etMb，肉的顏色也隨之變?yōu)樽睾稚?。由于Mb中鐵的易氧化性，致使肉品在貯藏及加工過程中極易發(fā)生明顯的顏色變化，從而造成其商品價(jià)值的降低。

除了可與O2配位結(jié)合以外，Mb也可與NO、CO結(jié)合生成亞硝基肌紅蛋白(nitrosylmyoglobin，MbNO)和碳氧肌紅蛋白(carboxymyoglobin，MbCO)，二者均呈鮮紅色。因此，在肉制品加工過程中，在國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法律法規(guī)許可范圍內(nèi)采用一定化學(xué)或物理方法選擇性改變Mb結(jié)構(gòu)以改善肉的色澤，這對(duì)提高產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值和競(jìng)爭(zhēng)力有重要作用。目前常用的肉品發(fā)色方法的原理都是通過將Mb轉(zhuǎn)變?yōu)镸bNO或MbCO。本文對(duì)已有的能夠改變Mb結(jié)構(gòu)從而改變?nèi)馄飞珴傻幕瘜W(xué)、物理方法的原理、應(yīng)用及不足進(jìn)行了總結(jié)并對(duì)其未來發(fā)展方向進(jìn)行了分析，以期為相關(guān)研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供參考。

1 化學(xué)方法

1.1 亞硝酸鹽

亞硝酸鹽作為最常用的發(fā)色劑，其應(yīng)用可以追溯到古代：過去人們使用鹵水、海水等腌制肉品以便長(zhǎng)期保存，被腌制后的肉品具有鮮艷的紅色，其機(jī)制正是由于鹵水、海水中的亞硝酸鹽與Mb反應(yīng)生成了MbNO[2]。亞硝酸鹽發(fā)色的原理是其在鮮肉的酸性條件下(主要是乳酸造成)生成亞硝酸[反應(yīng)式(1)]，后者極不穩(wěn)定，易分解生成NO[反應(yīng)式(2)]，后者可與Mb結(jié)合生成MbNO[反應(yīng)式(3)][3]。

(1)

HNO2+H++e-→NO+H2O

(2)

Mb Fe2++NO→MbFe2+-NO

(3)

雖然目前亞硝酸鹽仍被廣泛應(yīng)用于腌肉制品加工，但其也有明顯的不足之處。首先，亞硝酸鹽與胃酸反應(yīng)會(huì)生成N2O3，后者可與人體蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物仲胺類化合物結(jié)合生成具有致癌性的N-亞硝胺[反應(yīng)式(4)][4]，這是亞硝酸鹽作為食品添加劑的最大問題。另外，亞硝酸鹽具有強(qiáng)氧化性，過量食用會(huì)導(dǎo)致血液中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，誘發(fā)高鐵血紅蛋白血癥[5]，造成人體組織中毒、呼吸中樞麻痹等與缺氧有關(guān)的癥狀，甚至引起窒息和死亡。此外，大量攝入亞硝酸鹽也會(huì)干擾碘代謝，降低甲狀腺對(duì)碘的吸收，導(dǎo)致甲狀腺腫大[6]。由于上述原因，亞硝酸鹽在肉制品加工中的應(yīng)用受到嚴(yán)格限制。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定每日允許攝食量≤0.2 mg/kg(體重，以亞硝酸鈉計(jì))，我國相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》)也規(guī)定腌臘肉制品中亞硝酸鹽最大添加量為 0.15 g/kg，最大殘留量為30 mg/kg(以亞硝酸鈉計(jì))。

除腌肉制品以外，還有研究顯示亞硝酸鹽對(duì)新鮮魚體也有明顯的發(fā)色作用。王晶[7]將羅非魚置于含0.5～2.0 g/kg亞硝酸鉀的溶液中暫養(yǎng)一定時(shí)間(0.5～2.0 h)后發(fā)現(xiàn)，魚片的a*值明顯增大。亞硝酸鹽活體發(fā)色的原理是其通過血液循環(huán)傳輸?shù)紧~肌肉組織中并與肌紅蛋白結(jié)合生成MbNO。用亞硝酸鉀溶液處理魚片也得到了類似的結(jié)果，且魚片中亞硝酸鹽含量均未超出國家標(biāo)準(zhǔn)。

雖然亞硝酸鹽具有一定的潛在危害，但由于其對(duì)肉制品色澤、質(zhì)地、風(fēng)味等的改善作用，及其較強(qiáng)的抑制微生物增殖的能力，目前尚未有能完全替代亞硝酸鹽的方法。提高亞硝酸鹽使用安全性以及尋找亞硝酸鹽替代物仍是重要研究?jī)?nèi)容。

1.2 植物提取物

近年來，植物源發(fā)色劑受到了越來越多研究人員的關(guān)注，它具有來源廣泛、發(fā)色效果好、綠色健康、富含多種天然活性成分和色素等優(yōu)點(diǎn)，并具有一定的抑菌和改善肉制品風(fēng)味的作用。已有研究顯示，芹菜、甜菜、菠菜和生姜等多種植物提取物都具有改變Mb結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)發(fā)色的作用，其原理為這些植物都富含硝酸鹽，后者在具有硝酸鹽還原能力的微生物(如菌瓦式微球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌等)的作用下被還原成亞硝酸鹽[8]，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)發(fā)色。因此，植物源發(fā)色劑在使用前都需要經(jīng)微生物發(fā)酵處理，將其中的硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}。

芹菜粉因硝酸鹽含量高、植物色素含量低、風(fēng)味溫和等優(yōu)點(diǎn)，是一種常用的植物源發(fā)色劑。為避免使用前發(fā)酵帶來的繁瑣，有研究人員將芹菜汁液經(jīng)發(fā)酵、濃縮等處理后得到亞硝酸鹽含量為10～15 g/kg的濃縮液，后者可直接商業(yè)化應(yīng)用[9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)相比于亞硝酸鹽，植物源發(fā)色劑能有效減小腌肉制品中亞硝酸鹽殘留量，其可能的原因是植物源發(fā)色劑含有多種抗氧化劑(還原劑)，后者能促進(jìn)亞硝酸鹽分解為NO[10]。常見的植物源發(fā)色劑及其應(yīng)用如表1所示。

表1 常見植物源發(fā)色劑及其應(yīng)用Table 1 Common botanical colorants and their applications

雖然植物源發(fā)色劑有諸多優(yōu)點(diǎn)，但也存在如下不足：(1)植物提取物一般都有獨(dú)特的風(fēng)味和顏色，會(huì)一定程度上改變?nèi)庵破吩械娘L(fēng)味。為防止對(duì)肉制品風(fēng)味產(chǎn)生不良影響，一般植物源發(fā)色劑的添加量都較低，如芹菜濃縮物的添加量通常控制在0.2%～0.4%[19]；(2)發(fā)酵后的植物源發(fā)色劑雖然含有較高濃度的亞硝酸鹽，但其在肉制品加工中的推薦使用量并不能完全抑制腐敗微生物的增殖，因而需要額外的減菌處理；(3)植物提取物中硝酸鹽含量受收獲條件、地域、植物自身特性等多種因素的影響，同時(shí)硝酸鹽的還原程度也受發(fā)酵時(shí)間、溫度和pH等影響，因此最終所得的植物源發(fā)色劑中亞硝酸鹽含量難以控制；(4)植物源發(fā)色劑還可能會(huì)引起部分人群發(fā)生過敏現(xiàn)象。為避免此問題，研究人員開發(fā)了一系列不含過敏原的發(fā)色劑，例如使用噴霧干燥技術(shù)從不含過敏原的瑞士甜菜中提取的甜菜發(fā)色劑[20]。因此，如何實(shí)現(xiàn)植物源發(fā)色劑的規(guī)范化生產(chǎn)和應(yīng)用是該技術(shù)實(shí)現(xiàn)廣泛實(shí)際應(yīng)用所需突破的瓶頸問題。

1.3 NO

近年來，有部分研究人員嘗試?yán)肗O溶液和NO氣體發(fā)色肉制品。溶液發(fā)色是指將NO氣體通入到含有一定濃度還原劑的脫氧的水中一定時(shí)間以制備飽和發(fā)色液，將待發(fā)色樣品置于發(fā)色液中一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)發(fā)色。氣體發(fā)色通常是將發(fā)色樣品置于經(jīng)惰性氣體稀釋的NO氣體中并保存一定時(shí)間。已有研究表明，NO發(fā)色速度快，效果穩(wěn)定，且亞硝酸鹽殘留量(約20 mg/kg)低于國家對(duì)加工肉制品亞硝酸鹽含量的限量標(biāo)準(zhǔn)(30 mg/kg)。此外，魚肉中的研究還顯示NO可有效延緩樣品的pH變化、抑制揮發(fā)性鹽基氮的生成和減小滴水損失等，這表明NO可延緩魚體腐敗、保持魚肉品質(zhì)。關(guān)于NO發(fā)色的研究如表2所示。

表2 NO在肉制品發(fā)色中的應(yīng)用Table 2 Applications of NO in coloring of meat products

雖然NO作為發(fā)色劑具有一定的應(yīng)有前景，但也有明顯的不足。NO具有較強(qiáng)的刺激性和一定的毒性，這是限制該方法應(yīng)用的主要原因。另外，NO易與空氣中的O2接觸而生成NO2，進(jìn)而生成亞硝酸根[反應(yīng)式(5)～(6)][24]，最終可能會(huì)生成亞硝胺等致癌物。因此，如何提高NO發(fā)色工藝的安全性以及抑制有毒有害副產(chǎn)物的生成是實(shí)現(xiàn)該方法實(shí)際應(yīng)用的重要研究?jī)?nèi)容。

NO+O2→NO2

(5)

NO+NO2+H2O→HNO2

(6)

1.4 CO

除了O2和NO，CO也可與Mb輔基血紅素中的鐵配位結(jié)合生成呈鮮紅色的MbCO。由于Mb與CO的親和力遠(yuǎn)大于其與O2的親和力，且生成的MbCO極其穩(wěn)定，因此CO發(fā)色的肉制品可長(zhǎng)時(shí)間保持鮮紅色[25]。CO發(fā)色的常用形式有氣調(diào)、浸泡和活體發(fā)色3種。氣調(diào)發(fā)色是指將肉品暴露在經(jīng)CO2、N2、空氣等稀釋的CO氣體(0.1%～5.0%)中一定時(shí)間，浸泡發(fā)色是將CO溶解于堿性液體中制成發(fā)色液，利用后者對(duì)樣品進(jìn)行浸泡處理。活體發(fā)色主要用于水產(chǎn)品，將CO通入水中并經(jīng)高壓高速旋轉(zhuǎn)剪切后形成微米級(jí)氣泡，發(fā)色對(duì)象通過呼吸作用吸入CO，后者經(jīng)血液循環(huán)而與Mb結(jié)合生成MbCO，此種方法的發(fā)色時(shí)間短且發(fā)色均勻。已有的關(guān)于CO發(fā)色的研究如表3所示。

表3 CO在肉品發(fā)色中的應(yīng)用Table 3 Applications of CO in coloring of meat products

由于MbCO的高穩(wěn)定性，CO發(fā)色后樣品能長(zhǎng)時(shí)間保持鮮紅色，因此可能會(huì)掩蓋腐敗。另外，由于CO對(duì)健康可能造成的危害，因此目前CO發(fā)色已被多國禁止。針對(duì)前者，有研究人員建議使用低濃度CO氣調(diào)發(fā)色，這樣既能達(dá)到在貨架期內(nèi)良好的發(fā)色效果，又不會(huì)掩蓋貨架期后肉品的腐敗變質(zhì)[30]。針對(duì)CO可能帶來的健康危害，多位研究人員的工作顯示發(fā)色所需的CO濃度不足以影響血液中碳氧血紅蛋白濃度，因此不足以對(duì)人體造成健康風(fēng)險(xiǎn)[31]。因此，CO發(fā)色仍具有應(yīng)用前景，但也需對(duì)其工藝和其在體內(nèi)的演變進(jìn)行更深入研究。

2 物理方法

2.1 冷等離子體(cold plasma, CP)

等離子體是指氣體在加熱或強(qiáng)電磁場(chǎng)作用下被部分或完全電離成電子、正負(fù)離子、基態(tài)或激發(fā)態(tài)原子或分子等多種粒子的混合體系，是物質(zhì)存在的第四態(tài)。根據(jù)其溫度的不同，等離子體可分為高溫等離子體和低溫等離子體，后者又可分為熱等離子體和CP[32]。作為一種新興的食品非熱加工方法，CP具有環(huán)境友好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，目前在殺菌、延長(zhǎng)食品貨架期方面已有較多研究。

除了上述應(yīng)用以外，近期還有研究顯示CP處理可以通過改變?nèi)馄分蠱b結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)發(fā)色。CP發(fā)色的原理為N2和O2在等離子體處理過程中被電離生成N、O等，后二者可與O2、N2等反應(yīng)生成多種氮氧化合物[反應(yīng)式(7)～(11)][33-34]。生成的NO可與Mb結(jié)合生成MbNO，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)色。

e+O2→O-+O

(7)

e+N2→N+N(2D)+e

(8)

O+N2→NO+N

(9)

N+O2→NO+O

(10)

NO+O3→NO2+O2

(11)

目前關(guān)于CP的研究總結(jié)如表4所示。

表4 CP處理用于肉品發(fā)色的研究 Table4 Studyon the direct CP treatment in the coloring of meat products

CP作為一種新型發(fā)色方法，具有清潔環(huán)保、發(fā)色效果好等優(yōu)點(diǎn)，在一定條件下可替代亞硝酸鹽而用于肉品加工，但其也存在以下不足：(1)CP直接處理過程中除了生成NO以外，還會(huì)生成多種活性氧基團(tuán)，后者可能會(huì)引起食品中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的氧化，導(dǎo)致肉制品褐變及營(yíng)養(yǎng)成分的變化。(2)CP處理需要高壓電源、等離子體發(fā)生裝置、控制裝置等，因此投入相對(duì)較高，且高壓可能會(huì)帶來一定的安全隱患。(3)其發(fā)色機(jī)制也還未完全明確。因此，該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用還需要更深入細(xì)致的研究。

2.2 等離子體活化水(plasma activated water, PAW)

PAW指等離子體處理后的水。已有多項(xiàng)研究顯示PAW可誘導(dǎo)肉制品中Mb形態(tài)的變化，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)色。并且，PAW處理的肉制品在感官特性等方面都接近于直接添加亞硝酸鹽。PAW發(fā)色原理為等離子體處理下生成的NO、NO2等多種氮氧化物溶解于水生成亞硝酸根、硝酸根等[反應(yīng)式(12)～(15)]，后者被還原生成了NO。并且，PAW呈弱酸性，其中的亞硝酸鹽會(huì)與H+反應(yīng)并生成亞硝酸[反應(yīng)式(16)]，更有利于發(fā)色[39]。PAW發(fā)色相關(guān)研究總結(jié)于表5。

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

作為一種新型發(fā)色方法，PAW具有發(fā)色效果顯著、氧化弱等優(yōu)點(diǎn)，有效避免了等離子體產(chǎn)生的多種活性氧/活性氮基團(tuán)引起的氧化損傷。但PAW的實(shí)際應(yīng)用還需對(duì)等離子體處理?xiàng)l件，發(fā)色工藝等進(jìn)行更深入的研究。等離子體工作氣體(如空氣、氮?dú)?、氧氣、氬氣?及作用方式(如介質(zhì)阻擋放電，等離子體射流等)都對(duì)PAW中各種成分及其含量有顯著影響。例如，INGUGLIA等[45]分別對(duì)水進(jìn)行了空氣和氮?dú)怆x子體射流處理，結(jié)果顯示，2種條件下處理10 min后所得PAW中亞硝酸含量分別為90～184 mg/kg、3～17 mg/kg。目前關(guān)于PAW發(fā)色的研究還集中在效應(yīng)研究階段，對(duì)其發(fā)色工藝及其可能的負(fù)面作用都還鮮有涉及。因此，需要根據(jù)樣品不同對(duì)PAW制備及發(fā)色條件、對(duì)樣品各成分的影響等進(jìn)行更深入細(xì)致的研究。

表5 PAW在肉制品發(fā)色中的應(yīng)用Table 5 Applications of PAW in coloring of meat products

3 物理化學(xué)耦合發(fā)色

除上述化學(xué)和物理方法外，還有研究顯示使用物理、化學(xué)耦合方法能更有效改變Mb結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)發(fā)色。類似于PAW，冷等離子體處理能夠顯著增加植物提取物中亞硝酸根和硝酸根等發(fā)色基團(tuán)的含量，后二者在植物中各種還原劑的作用下被還原生成NO，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)色。本文將物理化學(xué)耦合發(fā)色的相關(guān)研究總結(jié)于表6。對(duì)影響該方法的因素、可能生成的副產(chǎn)物及其影響等都還需進(jìn)一步深入研究。

表6 物理化學(xué)耦合技術(shù)在肉品發(fā)色中的研究Table 6 Study on the physical and chemical coupling methods in coloring of meat products

4 結(jié)語

目前已有的通過改變Mb結(jié)構(gòu)而發(fā)色的化學(xué)、物理方法中，直接添加亞硝酸鹽仍最常用，其不僅能改善肉品色澤，還具有抑菌、改善風(fēng)味等作用，但其安全性是最受關(guān)注的問題。因此，提高亞硝酸鹽的使用安全性以及尋找亞硝酸鹽有效替代物一直都是肉制品生產(chǎn)和研究的重要內(nèi)容。植物源發(fā)色劑作為一種新型天然發(fā)色劑，具有來源廣泛、發(fā)色效果佳等優(yōu)點(diǎn)，但也存在對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生一定負(fù)面影響、抑菌能力弱、發(fā)色效果受多種因素制約等不足，降低其對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味等的影響和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)與應(yīng)用是其未來應(yīng)用的重要研究?jī)?nèi)容。NO和CO氣體發(fā)色均具有發(fā)色快、效果好且穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但前者具有極強(qiáng)的刺激性，后者具有極大的安全隱患，且CO發(fā)色的產(chǎn)品所具有的長(zhǎng)期穩(wěn)定紅色還有掩蓋腐敗變質(zhì)的弊端。因此，提高氣體發(fā)色工藝的安全性和發(fā)色后肉制品的食用安全性等都需要深入研究。CP作為一種新型非熱加工方法，其本身及PAW都具有發(fā)色作用，是亞硝酸鹽的一種可能替代方案，但也具有對(duì)被發(fā)色樣品造成氧化等負(fù)面影響。優(yōu)化CP發(fā)色的工藝參數(shù)和減弱其對(duì)發(fā)色樣品的負(fù)面影響是該技術(shù)實(shí)際應(yīng)用所需解決的瓶頸問題。物理化學(xué)耦合方法作為新型肉品發(fā)色方法，其優(yōu)勢(shì)及可能的不足都需進(jìn)一步的研究。本文內(nèi)容可為相關(guān)研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供參考。