基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)快速測(cè)定果梅中化學(xué)成分

夏夢(mèng)秋，王星晨，楊蘭香，岳婧怡，王瑞，曹侃，程旺開*

1(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)2(蕪湖生命健康工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

果梅為薔薇科植物梅PrunusmumeSieb.et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)，原產(chǎn)于川、鄂山區(qū)[1]。目前，福建、云南、四川、安徽、江蘇和浙江等地均有栽培[2]。果梅酸甜、肉質(zhì)飽滿，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含有機(jī)酸、氨基酸、糖類和黃酮等[3-4], 具有抗菌[5]、抗氧化[6]、抗病毒[7]等生物活性，在醫(yī)藥和食品方面用途廣泛。且果梅中有機(jī)酸類(檸檬酸、蘋果酸、綠原酸等)被認(rèn)為是一類主要的消炎和抗菌的化合物。芹菜素、槲皮素、蘆丁和山奈酚等黃酮類化合物中，對(duì)于惡性細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用。

果梅傳統(tǒng)的處理方法用松木熏蒸，在60～80 ℃的溫度下熏蒸2～3 d。然而，傳統(tǒng)的熏蒸與高時(shí)間和人工成本有關(guān)，在一些生產(chǎn)地區(qū)采用熱風(fēng)干燥方法進(jìn)行低溫干燥。研究發(fā)現(xiàn)，熱風(fēng)干燥與松木熏蒸后果實(shí)中的顏色和活性成分不同[8]。因此，考察不同的干燥條件對(duì)果梅中成分的影響對(duì)于指導(dǎo)果梅加工有重要意義。

目前，生物活性成分通常使用高效液相色譜[9]進(jìn)行分析。然而，在運(yùn)用高效液相色譜時(shí),多組分含量測(cè)定不夠準(zhǔn)確[10-11]。相比之下，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)集成了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度和選擇性，使該方法比高相液相色譜更適合用于與食品相關(guān)的多組分復(fù)雜體系的分離和分析。因此，建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)方法用于檢測(cè)不同干燥果梅中16種活性成分，并構(gòu)建了綜合評(píng)價(jià)模型，旨在為采后果梅果實(shí)品質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸櫞酸、蘋果酸、咖啡酸、富馬酸、綠原酸、原兒茶酸、琥珀酸、奎寧酸、蘆丁、山奈酚、熊果酸、苦杏仁苷、芹菜素、槲皮素、5-羥甲基糠醛，純度均≥98%，上海元業(yè)生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈，均為質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)Merck公司。

本研究收集了四川和福建2個(gè)產(chǎn)地的樣品，詳細(xì)樣品信息見表1。

表1 樣品采集信息表Table 1 Sample collection information table

1.2 儀器與設(shè)備

QUAD-4500三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，美國(guó)ABSCIEX公司；ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm,3.5 μm)，Millipore Q超純水系統(tǒng)，Millipore公司；十萬分之一電子天平，瑞士METTLER公司；JK-5200B超聲清洗器，合肥機(jī)械制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

精密稱定樣品粉末(1 g)，置入50 mL離心管，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇，稱重，超聲30 min,放冷，補(bǔ)重，離心，過0.22 μm濾膜，取濾液、即得。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取苯甲酸、槲皮素、咖啡酸、富馬酸、綠原酸、原兒茶酸、琥珀酸、奎寧酸、蘆丁、枸櫞酸、蘋果酸、山奈酚、熊果酸、苦杏仁苷、芹菜素、5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，分別置于25 mL容量瓶中，加入超純水配制成0.11、0.12、1.24、2.66、1.25、1.35、2.47、2.65、1.39、12.37、6.18、0.43、2.21、0.65、2.58、0.97 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.3 UPLC-MS/MS條件

流動(dòng)相條件：采用ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱。流動(dòng)相：水(含0.2%體積分?jǐn)?shù)甲酸)(A)和乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸)(B)。梯度洗脫：0～3 min, 10%～30% A;3～7 min, 30%～50% A;7～10 min, 50%～80% A;10～14.5 min,80%～10% A;14.5～17 min, 10% A。柱溫30 ℃，流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源( electrospray ionization, ESI),采取多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)檢測(cè),離子化溫度550 ℃，噴霧電壓5.5 kV,離子化溫度550 ℃,Gas1為379.2 kPa(55 psi),Gas2為379.2 kPa(55 psi),氣簾氣(N2)241.3 kPa(35 psi)。監(jiān)測(cè)16種成分離子對(duì)，去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能量(collision energy，CE)見表2。被測(cè)成分的提取MRM模式色譜圖見圖1。

表2 化合物的保留時(shí)間和相關(guān)質(zhì)譜(MS)數(shù)據(jù)Table 2 Retention times and related mass spectrometry (MS) data of the target compounds

1.3.4 檢測(cè)限、定量限和線性關(guān)系考察

取“1.3.2”項(xiàng)下不同濃度的對(duì)照品濃度及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 μL，梯度稀釋。按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行3次，以質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)與峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，線性范圍，相關(guān)系數(shù)(r)。以信噪比(S/N)約為3計(jì)算各成分的檢測(cè)限(limit of detection，LOD)，以信噪比(S/N)約為10，計(jì)算各成分的定量限(limit of quantitation，LOQ)。結(jié)果見表3，表明16種成分在各自的線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。

1.3.5 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液1 μL，進(jìn)樣6次，通過測(cè)定各對(duì)照品的峰面積并計(jì)算16種對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S1樣品6份，每份1.0 g，按照“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算16種目標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S1樣品的溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h時(shí)，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算16種目標(biāo)成分峰面積的RSD。

圖1 十六種組分的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 16 components

表3 十六種化學(xué)成分的線性關(guān)系考察Table 3 linear relationship of 16 chemical components

加樣回收率試驗(yàn)：取S1樣品6份，每份1.0 g，分別加入與1.0 g樣品中各待測(cè)成分含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，照“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試溶液，進(jìn)樣。

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)：精密稱取已知含量的果梅內(nèi)容物約4.0 g，共15份，按1.3.2項(xiàng)下方法配制的對(duì)照品溶液吸取1 μL稀釋成3個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液,配制成加標(biāo)溶液，每個(gè)濃度水平5份,作為A樣, 測(cè)得含量為A。未添加對(duì)照品溶液的已知含量的果梅為B樣, 測(cè)得含量為B。空白對(duì)照品溶液為C樣, 測(cè)得含量為C。按公式(1)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)[11]：

(5)

考察結(jié)果見表4，各成分的日內(nèi)和日間精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性分別為1.28%～2.79%, 1.78%～2.79%, 1.41%～2.96%和1.74%～2.89%,平均加樣回收率為95%～104%，RSD為2.01%～3.69%，表明該方法良好。在本次實(shí)驗(yàn)中，16種成分分離良好, 基質(zhì)效應(yīng)為98.5%～102.15%, 基質(zhì)成分不干擾16種成分的測(cè)定?？赡苁怯捎诖郎y(cè)組分與樣品中的基質(zhì)成分在霧滴表面離子化過程不存在競(jìng)爭(zhēng)，所以基質(zhì)對(duì)于所測(cè)定成分的定量影響并不大，因此可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本方法定量的影響[12]。

1.3.6 樣品測(cè)定

按照“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，根據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中16種化學(xué)成分的含量，結(jié)果見表5。

表4 十六種化學(xué)成分的方法學(xué)考察Table 4 Methodology investigation of 16 chemical constituents

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和液相條件

采用全掃描質(zhì)譜方法以2種ESI+/-模式檢查目標(biāo)化合物，以獲得最佳的質(zhì)譜條件。結(jié)果表明，熊果酸、苦杏仁苷、芹菜素和5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品在正離子模式下的靈敏度和強(qiáng)度高于負(fù)離子模式，其余標(biāo)準(zhǔn)品在負(fù)離子模式下較好。根據(jù)質(zhì)譜的穩(wěn)定性和離子響應(yīng)，自動(dòng)選擇了2個(gè)前體/產(chǎn)物對(duì)，在MRM模式下進(jìn)行進(jìn)一步分析，以提高分析的選擇性和靈敏度。

2.2 含測(cè)結(jié)果

本節(jié)建立UPLC-MS/MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定12份果梅樣品的16種成分(10個(gè)有機(jī)酸類、4個(gè)黃酮類、苦杏仁苷和5-羥甲基糠醛)，結(jié)果表明樣品中有機(jī)酸組成和含量有一定差異，枸櫞酸含量為13.28%～16.85%，均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)(含量不得少于12%)，蘋果酸、富馬酸、奎尼酸、琥珀酸含量次之，原兒茶酸和苯甲酸含量較低。在黃酮類化合物中以芹菜素含量最高,槲皮素含量最低。此外，果梅中還測(cè)定了苦杏仁苷和5-羥甲基糠醛，含量分別為1.59%和1.60%。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果 單位：μg/g

2.3 主成分分析及綜合評(píng)價(jià)

將12份樣品中測(cè)定的含量導(dǎo)入SPSS 24.0軟件，進(jìn)行主成分分析，根據(jù)特征值大于1的原則，篩選出5個(gè)主成分，總貢獻(xiàn)率達(dá)到84.38%。結(jié)果見表6。采用SPSS 24.0進(jìn)行主成分分析時(shí)，得到5個(gè)主成分因子，分別為F1、F2、F3、F4、F5。采用綜合評(píng)價(jià)函數(shù)為F=0.307 9F1+0.228 8F2+0.165 0F3+0.076 9F4+0.065 8F5，得到果梅樣品總因子得分值F及排名，具體見表7。由表7可知，熏制的果梅樣品綜合品質(zhì)表較好。

表6 主成分分析特征值及其貢獻(xiàn)率Table 6 Principal component analysis eigenvalues and their contribution rate

表7 果梅樣品綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Table 7 Comprehensive evaluation results of the samples

3 討論與結(jié)論

為了確定最佳的提取條件，根據(jù)課題組前期條件[11]，選擇了3個(gè)因素，并對(duì)每個(gè)組分的性質(zhì)進(jìn)行了研究和優(yōu)化：提取溶劑(水，體積分?jǐn)?shù)50%甲醇，體積分?jǐn)?shù)80%甲醇)、溶劑與樣品的比例(15∶1、25∶1和35∶1,體積比)、提取時(shí)間(20、30、40 min)對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明，使用80%甲醇, 溶劑與樣品的比例為25∶1，超聲時(shí)間為30 min時(shí)提取效率最優(yōu)。在初步實(shí)驗(yàn)中研究了色譜條件，如柱型、流動(dòng)相組成和pH，以獲得理想的色譜剖面，并優(yōu)化了保留時(shí)間和峰形，沒有明顯的峰尾。比較了2種柱型，BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)和ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱，以優(yōu)化目標(biāo)分析物的保留時(shí)間。結(jié)果表明，在相同條件下，ZORBAX SB-C18色譜柱對(duì)所有分析物的保留能力強(qiáng)、分辨率好、分析時(shí)間短。至于流動(dòng)相，與甲醇相比，乙腈具有更好的洗脫能力、分離選擇性和峰形。本文考察比較了乙腈/水和甲醇/水2種流動(dòng)相組成中，相比之下，在乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸)/0.2%甲酸水流動(dòng)相體系下，能在最短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生最佳的峰。

本研究成功地建立了一種快速、靈敏的UPLC-QUAD-MS/MS方法，并在20 min內(nèi)測(cè)定了果梅中16種活性成分，為果梅藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。