植物乳桿菌發(fā)酵動力學及高密度培養(yǎng)研究

賴長龍，曹余，楊玉，李紅艷，范亞葦，鄧澤元

(南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一種兼性厭氧細菌，在缺氧條件下能夠進行發(fā)酵，將糖轉(zhuǎn)化為乳酸[1]。乳酸菌有多種健康益處，包括替代抗生素、降低膽固醇水平、維持腸道菌群平衡和提高免疫力[2-3]。據(jù)國際乳業(yè)聯(lián)合協(xié)會建議，食品中益生菌活菌數(shù)最低為107CFU/g或107CFU/mL，以確保益生菌對宿主發(fā)揮有益作用[4]。因此，生產(chǎn)上通過高密度培養(yǎng)(high cell density culture，HCDC)來獲得足夠數(shù)量的益生菌，以發(fā)揮其促進宿主健康的作用。乳酸菌的生長受培養(yǎng)基組成、pH、溫度、接種量和代謝產(chǎn)物的影響較大[5]。由于乳酸菌對營養(yǎng)的要求非常嚴格，因此需要豐富的培養(yǎng)基來促進生長。在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方法中，響應曲面法(response surface methodology，RSM)得到了廣泛的應用[6]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(artificial neural network，ANN)是一種基于生物神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構和功能的計算模型，在非線性統(tǒng)計數(shù)據(jù)建模上具有較高的精度和泛化能力[7]。一些研究表明，ANN相較于RSM在發(fā)酵條件優(yōu)化方面具有更好的擬合效果[8]。遺傳算法(genetic algorithm，GA)是一種基于達爾文“適者生存”理念的啟發(fā)式優(yōu)化算法，采用遺傳算子如選擇、突變和交叉，以找到最優(yōu)的問題解決方案[9]。在最近的研究中，ANN-GA混合模型已被證明預測精度高，穩(wěn)定性好[10]。高密度培養(yǎng)主要通過添加堿性溶液控制培養(yǎng)基pH來降低酸抑制作用。在此基礎上，通過分批補料策略來提高菌體產(chǎn)量[11]。本研究通過單因素試驗對植物乳桿菌的碳源、氮源和緩沖鹽進行了優(yōu)化，同時基于響應面試驗設計，利用ANN-GA混合模型對培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化。在此基礎上，對植物乳桿菌發(fā)酵過程進行模擬，建立了發(fā)酵動力學方程。在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，通過間歇補料方式，進一步提高菌體產(chǎn)量，為植物乳桿菌的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，分離自江西省萍鄉(xiāng)市成品搓菜，由本實驗室保藏。MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，檸檬酸二銨2，葡萄糖10，Tween-80 l mL，磷酸氫二鉀2，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·H2O 0.25，自然pH值。

1.2 儀器與設備

DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；HWS-150型恒溫恒濕箱，上海精宏實驗設備有限公司；雷磁PHS-25型數(shù)顯pH計，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；EXL800全自動酶標儀，美國Biotek Instruments有限公司；THZ-82 N臺式恒溫振蕩器，上海躍進醫(yī)療器械廠；AR1140電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化與指標測定

L.plantarum菌種保藏于甘油凍存管中，每次實驗前將菌種以3%接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，活化2代。

菌體生物量的測定采用烘干法，即取一定量發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min去除上清液，用生理鹽水洗滌菌體2次，于105 ℃烘干至恒重后稱量[12]。然后，將OD600值轉(zhuǎn)換成菌體干重(dry cell weight，DCW)，由實驗測定，DCW(g/L)=10.87×OD600-0.096 9。

還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測定[13]。簡要地，取1 mL稀釋發(fā)酵液，加入2 mL DNS試劑于100 ℃下水浴5 min。冷卻后定容至15 mL，于540 nm測定吸光度。

乳酸含量采用紫外分光光度法測定[14]。用離心機將發(fā)酵液從菌體中分離出來，上清液用去離子水稀釋10倍。取50 μL稀釋后的上清液加入到2 mL的2 g/L氯化鐵溶液中，在390 nm下測定吸光度。

1.3.2 碳源、氮源和緩沖鹽優(yōu)化

以植物乳桿菌為研究對象，在MRS培養(yǎng)基的基礎上，對不同種類的碳源、氮源和緩沖鹽進行了優(yōu)化，用20 g/L的不同碳源和25 g/L的不同氮源分別替代MRS培養(yǎng)基中已有的碳源或氮源，而所有其他成分保持在固定水平。通過測定生物量確定不同物質(zhì)對植物乳桿菌生長促進作用。

1.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗設計

利用RSM中的中心組合設計(central composite design，CCD)進行試驗，對植物乳桿菌培養(yǎng)基的碳源、氮源、緩沖鹽進行優(yōu)化，以菌體生物量為響應值，確定培養(yǎng)基中主要成分的最優(yōu)配比。其中碳源含量(X1)、氮源含量(X2)、檸檬酸二銨含量(X3)為自變量，試驗因素及水平設計如表1所示。

表1 CCD參數(shù)水平設計Table 1 Levels of CCD parameter design

1.3.4 ANN模型

ANN是一種受大腦和神經(jīng)系統(tǒng)研究啟發(fā)的數(shù)學算法。它可以連接輸入和輸出參數(shù)，通過迭代從示例中學習，而不需要關于過程變量之間關系的先驗知識[15]。隱藏層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為tansig，輸出層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為purelin，采用trainbr方法進行訓練，當均方誤差(mean square error，MSE)達到1×10-3時，訓練停止[16]。通過試錯法，比較不同神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構預測實際值的能力，確定隱藏層神經(jīng)元的數(shù)量。在此過程中，采用MSE作為質(zhì)量參數(shù)，在不同結(jié)構中選擇最優(yōu)結(jié)構。本實驗選擇碳源(X1)、氮源(X2)和緩沖鹽(X3)作為模型輸入，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡算法，以菌體生物量作為模型輸出，建立單隱藏層和雙隱藏層神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構。通過比較單隱藏層和雙隱藏層結(jié)構的MSE，確定最優(yōu)神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構。MSE的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：N為樣本數(shù)量；Yp,i為預測值；Ya,i為實際值。

1.3.5 GA

GA已經(jīng)證明了它能夠以最優(yōu)性能優(yōu)化各種線性和非線性問題，該算法基于自然進化原理，利用交叉和變異來保持最優(yōu)個體的生存[17]。ANN-GA混合算法模型將訓練好的ANN網(wǎng)絡結(jié)構作為遺傳算法的適應度函數(shù)，以菌體干重為響應變量，通過尋找全局最優(yōu)解，獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組合。遺傳算法參數(shù)設定如下：變量類型為實數(shù)型，種群大小50，最大迭代數(shù)500，交叉概率0.8，變異概率0.1。

1.3.6 發(fā)酵動力學

微生物發(fā)酵動力學模型主要有結(jié)構化和非結(jié)構化模型，與結(jié)構化模型相比，非結(jié)構化模型更易于對間歇發(fā)酵進行預測和監(jiān)測[18]。根據(jù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，建立植物乳桿菌的菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物生成模型，每隔2 h測定其培養(yǎng)過程中的生物量、乳酸和殘?zhí)橇?，計算出動力學模型的參數(shù)，預測其發(fā)酵過程變化。

對于菌體生長動力學，Logistic方程是一個與底物無關的模型，可以很好地描述微生物生長過程[19]。菌體生長Logistic方程的表達如公式(2)所示：

(2)

式中：X，菌體生物量，g/L；X0，菌體初始生物量，g/L；Xm，菌體最大生物量，g/L；μm，最大比生長速率，g/(L·h)；t，時間，h。

植物乳桿菌產(chǎn)物生成模型符合“S”型曲線，使用Logistic方程預測產(chǎn)物生成模型，方程的表達如公式(3)所示：

(3)

式中：P，菌體乳酸含量，g/L；P0，菌體初始乳酸含量，g/L；Pm，菌體最大乳酸含量，g/L；μm1，最大比生成速率，g/(L·h)；t，時間，h。

植物乳桿菌底物消耗動力學使用Luedeking-Piret模型，該模型既考慮了菌體自身維持生長的底物消耗，也考慮了底物向菌體生物量和代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化[5]。鑒于菌體用于維持自身的底物消耗遠低于菌體生物量和產(chǎn)物生成量的底物消耗，故對Luedeking-Piret模型進行簡化，方程的表達如公式(4)所示：

(4)

式中：S，殘?zhí)橇?，g/L；S0，初始殘?zhí)橇?，g/L；YX/S，菌體得率系數(shù)，g/g；YP/S，產(chǎn)物得率系數(shù)，g/g；t，時間，h。

1.3.7 培養(yǎng)條件和分批補料優(yōu)化

以植物乳桿菌菌體干重為指標，通過對溫度、初始pH和接種量進行優(yōu)化，繪制其發(fā)酵動力學曲線。在此基礎上進行補料優(yōu)化，采用間歇補料方式，研究中和劑、補料濃度和補料次數(shù)對菌體密度的影響。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均進行3次平行測定，響應面設計采用Design-Expert軟件進行設計與分析，ANN和GA分別采用R語言中的NeuralNetTools和GA開源軟件包[20-21]，使用Origin進行數(shù)據(jù)分析和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源和氮源優(yōu)化

不同種類的碳源和氮源對植物乳桿菌生長的影響如圖1所示。圖1-a顯示，麥芽糖對菌體生長的促進作用最為顯著，生物量最高可達6.38 g/L，葡萄糖和麥芽糖(質(zhì)量比2∶3)次之，菌體量可達6.28 g/L?？梢园l(fā)現(xiàn)，相較于葡萄糖，麥芽糖對植物乳桿菌生長促進效果更好，可能是因菌體快速利用葡萄糖產(chǎn)酸，降低培養(yǎng)基的pH，抑制其自身的生長。考慮到單獨使用麥芽糖的成本較高，因此選擇葡萄糖和麥芽糖作為最佳碳源。如圖1-b所示，有機氮源顯著優(yōu)于無機氮源，而當選擇酵母粉和蛋白胨(質(zhì)量比1∶1)為氮源時，菌體最大產(chǎn)量為6.7 g/L。一些研究表明，酵母粉和低成本的蛋白胨作為氮源時，對乳酸菌生長有顯著影響[22]。相較于使用單一氮源，酵母粉復合大分子肽的蛋白胨對植物乳桿菌的生長有顯著促進作用。不同濃度的復合碳源和復合氮源對菌體的生長有著重要的影響。復合碳源質(zhì)量濃度為30 g/L時，菌體最大產(chǎn)量為6.96 g/L(圖1-c)。復合氮源質(zhì)量濃度為25 g/L時，菌體最大產(chǎn)量為7.27 g/L(圖1-d)。

a-碳源種類優(yōu)化；b-氮源種類優(yōu)化；c-復合碳源濃度優(yōu)化；d-復合氮源濃度優(yōu)化圖1 不同碳源和氮源對植物乳桿菌生物量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources and nitrogen source on the biomass of L.plantarum

2.2 緩沖鹽優(yōu)化

乳酸菌在生長過程中代謝碳水化合物生成乳酸，降低培養(yǎng)基pH，抑制菌體生長[23]。在培養(yǎng)基中添加緩沖鹽可以在一定程度上平衡pH，降低對菌體的抑制作用。本研究對不同濃度的緩沖鹽體系進行了研究，如表2所示，菌體量最初隨著緩沖鹽濃度的增加而增加，但隨后隨著緩沖鹽濃度的增加而減少。可以看到，當檸檬酸二銨質(zhì)量濃度為25 g/L時，培養(yǎng)基緩沖效果最好，菌體生物量可達6.46 g/L。

表2 不同緩沖鹽體系對菌體生物量的影響Table 2 Effects of different buffer systems on bacterial biomass

2.3 ANN模型建立

本研究以CCD試驗設計數(shù)據(jù)作為訓練樣本，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡建立ANN模型(表3)。對于構建神經(jīng)網(wǎng)絡模型，首先需要確定最優(yōu)網(wǎng)絡結(jié)構。如圖2-a和圖2-b所示，單隱藏層神經(jīng)元數(shù)量為9時，MSE最小為0.009 1。雙隱藏層神經(jīng)元數(shù)量為7和9時，MSE最小為0.024 2。如圖2-c所示，單隱藏層模型相較于雙隱藏層模型對生物量擬合效果更好，MSE分別為0.009 4 和0.161 7。因此，本研究選用單隱藏層網(wǎng)絡結(jié)構模型進行預測，結(jié)構模型如圖3-a所示。人工神經(jīng)網(wǎng)絡在優(yōu)化發(fā)酵條件方面取得了很大的成功，YANG等[15]利用ANN建立協(xié)同發(fā)酵法以提高真菌蒽醌產(chǎn)量和抗氧化活性，蒽醌產(chǎn)量提高至2.11%。

2.4 GA優(yōu)化

將神經(jīng)網(wǎng)絡模型作為GA的適應度函數(shù)，采用GA求解器進行過程優(yōu)化，從而得到問題最優(yōu)解[24]。如圖3-b所示，經(jīng)過369次迭代，確定了植物乳桿菌生物量最佳輸入條件，分別是復合碳源36.64 g/L、復合氮源47.83 g/L和檸檬酸二銨33.27 g/L，輸出值為11.02 g/L。同時，在最優(yōu)條件下的生物量實驗值為10.86 g/L，誤差值<2%。實驗值與預測值吻合較好，說明所生成的ANN-GA模型具有良好的預測和優(yōu)化能力。

表3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡訓練樣本試驗設計Table 3 Training experimental design for BP neural network

a-單隱藏層BP神經(jīng)網(wǎng)絡MSE；b-雙隱藏層BP神經(jīng)網(wǎng)絡MSE；c-單隱藏層和雙隱藏層BP神經(jīng)網(wǎng)絡實際值與預測值比較圖2 ANN模型的確定Fig.2 Determination of the ANN model

2.5 發(fā)酵動力學

2.5.1 發(fā)酵過程動力學曲線

如圖3-c所示為植物乳桿菌在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下細胞干重、殘?zhí)橇?、pH和乳酸變化情況。在0～4 h，菌體處于滯后期，由于初始糖含量較高，基質(zhì)消耗多用于菌體自身的乳酸代謝，導致細胞干重變化較小，發(fā)酵液pH迅速降至4.3左右。在4～20 h，菌體處于對數(shù)生長期，糖含量降至4 g/L，pH為3.7左右，細胞干重迅速增加。在培養(yǎng)30 h后，獲得最大細胞干重10.59 g/L，乳酸含量增至19.78 g/L?？梢钥吹?，發(fā)酵液乳酸含量和殘?zhí)橇吭?6 h趨于穩(wěn)定，菌體對數(shù)期最大生長速率為0.292 g/(L·h)。

a-BP神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構模型；b-GA最優(yōu)值和平均值迭代優(yōu)化；c-發(fā)酵動力學曲線圖3 ANN-GA模型優(yōu)化和發(fā)酵動力學曲線Fig.3 ANN-GA model optimization and fermentation kinetic curve

2.5.2 動力學參數(shù)擬合

根據(jù)公式(2)，對生物量進行模型擬合，得到生長動力學擬合參數(shù)X0=0.512 g/L，Xm=10.63 g/L，μm=0.292 g/(L·h)。如圖4-a所示，R2=0.995，說明Logistic方程可以很好地描述該發(fā)酵條件下的生長動力學。乳酸菌發(fā)酵通過碳水化合物代謝產(chǎn)生乳酸作為主要的代謝最終產(chǎn)物，乳酸的積累是抑制其自身生長的主要因素[25]。根據(jù)公式(3)，對產(chǎn)物生成進行模型擬合，得到產(chǎn)物生成動力學擬合參數(shù)P0=0.51 g/L，Pm=19.768 g/L，μm1=0.394 g/(L·h)。如圖4-b所示，R2=0.998，說明該方程對植物乳桿菌產(chǎn)物生成擬合較好。在微生物發(fā)酵過程中，底物主要轉(zhuǎn)化為細胞質(zhì)量、產(chǎn)物和維持細胞基本生命活動[26]。根據(jù)公式(4)，對底物消耗進行模型擬合，得到底物消耗動力學擬合參數(shù)S0=33.967 g/L，YX/S=1.755 g/g，YP/S=0.753 g/g。如圖4-c所示，R2=0.993，Luedeking-Piret方程很好地描述了底物消耗動力學。

a-生長動力學模型擬合曲線；b-產(chǎn)物生成動力學模型擬合曲線；c-底物消耗動力學模型擬合曲線圖4 植物乳桿菌發(fā)酵動力學方程擬合Fig.4 Fermentation kinetic equation fitting of L.plantarum

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素試驗研究了不同初始pH、發(fā)酵溫度和接種量對植物乳桿菌生物量的影響。由圖5-a可知，在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，培養(yǎng)溫度為35 ℃時，植物乳桿菌生長效果最好。在35 ℃時，初始pH和接種量對植物乳桿菌生長影響顯著。最適初始pH因菌種而異，乳酸菌有一定的耐酸性，如圖5-b所示，在pH=5.0時有最高的菌體量，隨著培養(yǎng)基初始pH升高，菌體生長也受到抑制。此外，接種量也是乳酸菌生長的重要參數(shù)，在培養(yǎng)過程中應保持在最優(yōu)值。由圖5-c可知，接種量為4%時，菌體生長效果最好。當接種量為5%時，菌體量下降，可能是由于接種量過大，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量菌體同時生長。

2.7 分批補料優(yōu)化

分批補料是發(fā)酵工業(yè)中提高生產(chǎn)效率最常用的方法之一。菌體在對數(shù)生長后期，對碳源的需求量較大，可通過補加碳源以提高產(chǎn)量。乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生有機酸快速降低環(huán)境pH，影響細胞膜滲透性和胞內(nèi)酶活性，流加中和劑以保持良好的發(fā)酵條件[19]。如圖6-a所示，NH3·H2O能顯著提高培養(yǎng)液中的菌體密度。本實驗研究了補加不同濃度的葡萄糖對乳酸菌生物量的影響，由圖6-b可知，過高的葡萄糖導致菌體產(chǎn)量降低，當補加葡萄糖至30 g/L時，菌體生物量最大。同時對葡萄糖補料次數(shù)進行了優(yōu)化，如圖6-c所示，單次補料生物量最大?？梢园l(fā)現(xiàn)，多次補加葡萄糖并未增加菌體生物量，一些研究表明，在分批補料發(fā)酵過程中，乳酸菌菌體產(chǎn)量主要受到產(chǎn)物抑制的影響[27]。因此，植物乳桿菌通過補入葡萄糖和NH3·H2O，菌體干重可達12.64 g/L。如圖6-d所示，分批補料的菌體產(chǎn)量較未補料提高了19%。

a-不同溫度對植物乳桿菌生物量的影響；b-不同初始pH對植物乳桿菌生物量的影響；c-不同接種量對植物乳桿菌生物量的影響圖5 植物乳桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of fermentation conditions for L.plantarum

a-不同中和劑對生物量的影響；b-葡萄糖濃度優(yōu)化；c-補料方式對生物量的影響；d-補料培養(yǎng)對生長曲線的影響圖6 植物乳桿菌分批補料優(yōu)化Fig.6 Fed-batch optimization of L.plantarum

3 結(jié)論

本實驗對植物乳桿菌發(fā)酵動力學及高密度培養(yǎng)進行了研究，通過單因素試驗，確定植物乳桿菌生長所需的最佳碳源、氮源和緩沖鹽，利用ANN-GA模型對培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為碳源36.64 g/L(葡萄糖-麥芽糖質(zhì)量比2∶3)、氮源47.83 g/L(酵母粉-蛋白胨質(zhì)量比1∶1)、檸檬酸二銨33.27 g/L。根據(jù)植物乳桿菌發(fā)酵動力學曲線得到菌體生長、產(chǎn)物生成及底物消耗動力學模型參數(shù)，相關系數(shù)R2分別為0.995、0.996、0.996，表明建立的模型能很好地預測植物乳桿菌發(fā)酵過程變化情況?；谧罴雅囵B(yǎng)基配方，對植物乳桿菌培養(yǎng)條件和補料方式進行了優(yōu)化，菌體產(chǎn)量可達12.64 g/L。