金抗肽SIF4基于糖代謝途徑和細胞質(zhì)膜氧化損傷的大腸埃希菌抑菌機理

李玉珍，肖懷秋,*，王琳，劉淼，曾夢琪，曹丹，趙謀明

1(湖南化工職業(yè)技術(shù)學院 制藥與生物工程學院，湖南 株州，412000)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510000)

食品加工和流通過程中易引入致病病原菌，大腸埃希菌(Escherichiacoli)是典型的食源性革蘭氏陰性菌，細胞結(jié)構(gòu)具有典型性和代表性，是最常見的低感染劑量、高致病性腸道病原體，可引起腹瀉和出血性結(jié)腸炎等消化道疾病，是食品公共衛(wèi)生領(lǐng)域的嚴重威脅，常作為模式菌株進行研究。葡萄糖氧化供能是微生物普遍存在的能量代謝途徑，也是脂肪與蛋白質(zhì)等生物大分子的終極代謝途徑。葡萄糖氧化代謝途徑關(guān)鍵酶若受到抑制，能量生成會受到影響并影響菌體正常生長[1]。大腸埃希菌通過葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將葡萄糖轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)生成磷酸葡萄糖[2]，經(jīng)糖酵解(embden-meyerhof-parnas，EMP)途徑生成丙酮酸，EMP途徑關(guān)鍵酶有己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)。丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶系(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)脫羧脫氫生成乙酰CoA，再與草酰乙酸縮合生成檸檬酸進入三羧酸(tricarboxylic acid cycle，TCA)循環(huán)并完成葡萄糖徹底氧化，TCA途徑關(guān)鍵酶有檸檬酸合成酶(citrate synthase，CS)、異檸檬酸脫氫酶(isocitric dehydrogenase，IDH)和α-酮戊二酸脫氫酶系(α-ketoglutaric dehydrogenase complex，α-KGDHC)[3]。ZHAO等[4]研究了月桂酸鹽對大腸埃希菌細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和細胞質(zhì)膜氧化損傷的膜損傷機理，陳旋等[5]和SHI等[6]分別研究了抗菌肽P7和烷基甘油酯對大腸埃希菌的非細胞質(zhì)膜損傷機理。由于細胞膜作為抗菌靶點可解決現(xiàn)有抗生素難以徹底殺滅減速生長期與休眠期細菌這一關(guān)鍵問題，且細胞膜結(jié)構(gòu)相對保守和快速殺菌效應(yīng)使得細胞膜效應(yīng)靶點具有天然優(yōu)勢[7]；此外，由于細菌細胞膜組分與真核生物細胞膜組分的差異使得以細胞膜作為效應(yīng)靶點具有更好細胞選擇性，且不易產(chǎn)生耐藥性[8]，目前抑菌機理以細胞質(zhì)膜靶點研究為主[9]。前期研究表明，金抗肽SIF4對大腸埃希菌有較好抑菌活性[4]，但抑菌機理不明。課題組認為，雖然細胞膜是抗菌肽優(yōu)選效應(yīng)靶點，但基于能量代謝關(guān)鍵酶靶點的非細胞質(zhì)膜損傷研究也同樣具有重要意義，特別是基于細胞質(zhì)膜/非細胞質(zhì)膜損傷靶點的協(xié)同抑菌機理研究更具重要意義[10]，試驗研究了金抗肽SIF4對菌體糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑關(guān)鍵酶、細胞質(zhì)膜氧化損傷和細胞內(nèi)源活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成的影響，以期從細胞質(zhì)膜/非細胞質(zhì)膜損傷這一視角揭示SIF4對大腸埃希菌抑菌機理，為食源性大腸埃希菌生物防控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

金抗肽SIF4，實驗室制備；大腸埃希菌ATCC25922從菌種保藏中心獲得；牛肉膏、胰蛋白胨，北京博星；磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、ATP、ADP、NADH、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等，上海源葉；醛縮酶、乳酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、PK、HK、PFK、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、草酰乙酸、二硫雙對硝基苯甲酸、硫代巴比妥酸等，Sigma；UV-2600紫外可見分光光度計，島津；Infinite F200 pro多功能酶標儀，Tecan。

1.2 實驗方法

1.2.1 金抗肽SIF4處理與粗酶液制備

將活化菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期(12 h)，準確吸取5 mL 菌液接種至45 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入SIF4至終質(zhì)量濃度為0、1/2、1和2 MIC[(最小抑菌濃度，minimum inhibitory concentration)，MIC=0.4 mg/L]，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)12 h，間隔4 h取1 mL培養(yǎng)物，4 500 r/min離心10 min，收集菌體，用1%(體積分數(shù)) TritonX-100的PBS懸浮細胞并超聲處理30 min(200 W，超聲5 s，間隔9 s)，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，細胞破碎上清液即粗酶液，粗酶液蛋白質(zhì)用Bradford法[11]測定。

1.2.2 糖酵解代謝途徑關(guān)鍵酶活性測定

利用NADH和NADPH在340 nm處有光吸收并產(chǎn)生熒光，而NAD+和NADP+無此特性，用酶標儀測定熒光值并計算酶活力。

(1)HK活性測定：參考SKARLATOS等[12]方法并稍做修改。移取0.5 mL酶液加入2.0 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0，含100 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L NADP+，1.2 mmol/LATP，300 mmol/L葡萄糖)，5 μg 6-磷酸脫氫酶，25 ℃反應(yīng)5 min，以不添加ATP組為空白。

(2)PFK活性測定：參考KOTLARZ等[13]方法并稍做修改。移取0.5 mL酶液加入2.0 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液[pH 8.0，含30 mmol/L MgCl2，60 mmol/L KCl，0.12 mmol/L NADPH，1.0 mmol/L ATP，0.2 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，1.0 mmol/L AMP，0.5 mmol/L 6-磷酸果糖]，加丙酮酸激酶50 μg，20 U乳酸脫氫酶，以不添加6-磷酸果糖組為空白。

(3)PK活性測定：參考MILLAR等[14]方法并稍做修改。移取0.5 mL酶液加入2.0 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，含1.2 mmol/L ADP，0.18 mmol/L NADH，150 mmol/L KCl，12 mmol/L MgCl2，1.1 mmol/L PEP)，20 U乳酸脫氫酶，以不添加PEP組為空白。

1.2.3 TCA循環(huán)途徑關(guān)鍵酶活性測定

(1)PDHC提取與測定：參考JENNER等[15]方法并稍做修改。取1 mL粗酶液加入1 mL酶提取液[pH 7.5，含80 mmol/L Na4P2O7，10 mmol/L K3PO4，0.3 mol/L甘露醇，10.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，10.0 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，2 mmol/L EDTA，25 mmol/L Cys]中，2 000 r/min離心5 min，上清液15 000 r/min離心20 min，將沉淀重懸浮于1 mL TES緩沖液(10 mmol/L Tes-KOH，pH 7.5，0.3 mol/L甘露醇，1.0 g/L BSA)，30 000 r/min離心45 min，上清液即為PDHC粗提液；取100 μL酶粗提液加入至2 mL酶反應(yīng)液[pH 7.5，75 mmol/L HEPES-NaOH，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NAD+，0.2 mmol/L CoA，2 mmol/L 焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate，TPP)，10 mmol/L Cys]，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L丙酮酸鈉激發(fā)反應(yīng)，測定340 nm光吸收值變化。

(2)CS提取與測定：參考JENNER等[15]和HIRAI等[16]方法并稍作修改。取1 mL粗酶液加入1 mL酶提取液[pH 7.3，含30 mmol/L HEPES-NaOH，10 mmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，1 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L EDTA，5.0 g/L BSA，5.0 g/L PVP，10 mmol/L Cys]，勻漿2 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即CS粗提液[15]；取100 μL酶粗提液加入2 mL反應(yīng)液(pH 9.0，含40 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L 二硫代二硝基苯甲酸，80 μmol/L 乙酰CoA)，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L草酰乙酸激發(fā)反應(yīng)，測定412 nm光吸收值變化。

(3)IDH提取與測定：參考JENNER等[15]方法并稍作修改。取1 mL粗酶液加入1 mL提取液(pH 6.9，含25 mmol/L HEPES-NaOH，1 mmol/L MgSO4，0.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，25%甘油，2.5 g/L BSA，2.5 g/L PVP，0.1%(體積分數(shù)) TritonX-100，100 mmol/L檸檬酸鈉)，勻漿2 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即IDH粗提液；取100 μL酶粗提液加入2 mL反應(yīng)液[pH 7.6，含40 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L NAD+，10 mmol/L MnCl2，0.05%(體積分數(shù))TritonX-100]，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L異檸檬酸鈉激發(fā)反應(yīng)，測定340 nm光吸收值變化。

(4)α-KGDHC提取與測定：參考PEKOVICH等[17]方法并稍作修改。取1 mL粗酶液加入1 mL酶提取液[pH 7.5，含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，0.01%(體積分數(shù))TritonX-100，0.2 g/L脫氧膽酸鈉，0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟]，勻漿2 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即α-KGDHC粗提液；取100 μL酶粗提液加入2 mL反應(yīng)液[pH 8.0，含50 mmol/L 3-嗎啉丙磺酸，2 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L CoA，10 mmol/L NAD+，0.5%(體積分數(shù))TritonX-100，0.04 mmol/L魚藤酮]，25 ℃保溫15 min，加入20 mmol/L α-酮戊二酸激發(fā)反應(yīng)，測定340 nm光吸收值變化。

1.2.4 對細胞質(zhì)膜氧化損傷的影響

取對數(shù)生長期菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5(約5×107CFU/mL)，加入SIF4至終質(zhì)量濃度為0、1/2、1和2 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，間隔4 h取樣1 mL培養(yǎng)物與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)等體積混合，煮沸15 min后立即轉(zhuǎn)入冰水浴中，室溫條件下12 000 r/min離心10 min。取300 μL上清液分別測定450、532、600 nm光吸收值并計算丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量[18],如公式(1)所示：

MDA/(nmol·mg-1protein) =10×[6.45×(A532-A600)-0.56×A450]

(1)

1.2.5 對細胞內(nèi)源ROS生成的影響

取對數(shù)生長期菌種接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5，加入SIF4至終質(zhì)量濃度為0、1/2、1和2 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，間隔4 h取樣1 mL培養(yǎng)物，6 500 r/min離心10 min，菌體沉淀用無菌PBS洗滌3次并重懸，向各組樣液加入100 μL 10 μmol/L 2.7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)溶液，37 ℃，120 r/min避光孵育1 h，測定488 nm處細胞懸液熒光強度以判定細胞內(nèi)源ROS水平[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1 對HK的影響

HK是糖酵解途徑第1個關(guān)鍵酶，負責ATP磷酸基團轉(zhuǎn)移至葡萄糖C6生成6-磷酸葡萄糖，需Mg2+或Mn2+參與。SIF4對HK活性的影響如圖1所示。

圖1 SIF4對己糖激酶的影響Fig.1 The effect of SIF4 on HK注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

由圖1可知，處理0～12 h時，1/2MIC組對HK活性影響不顯著(P>0.05)，隨著SIF4處理劑量的增加，HK活性顯著降低(P<0.05)，特別是2MIC組，可能是由于HK為別構(gòu)酶，SIF4對HK的別構(gòu)抑制效應(yīng)存在量效關(guān)系[20]，SIF4可能通過與HK的別構(gòu)亞基結(jié)合而影響酶活性，從而對EMP實施調(diào)控，與其他小分子物質(zhì)對HK活性影響機制相似[21]。2MIC組處理4、8、12 h時，HK活性分別降至對照組的53.23%、41.94%和33.39%。

2.1.2 對PFK的影響

PFK負責催化6-磷酸果糖為1,6-二磷酸果糖，pfkA和pfkB基因可編碼同工酶Ⅰ和Ⅱ，PFK I約占90%，是糖酵解途徑第2個關(guān)鍵酶和標志酶[22]。SIF4對PFK的影響如圖2所示。

圖2 SIF4對磷酸果糖激酶的影響Fig.2 The effect of SIF4 on PFK

由圖2可知，試驗組與對照組PFK活性均存在顯著差異(P<0.05)。SIF4處理劑量(x)與PFK活性(y)呈現(xiàn)負相關(guān)，1/2、1和2 MIC組線性回歸方程分別為y=-0.003x+0.254 5(R2=0.948 2)、y=-0.003 8x+0.245 5(R2=0.704 6)和y=-0.005 5x+0.237 6(R2=0.574 7)。隨著SIF4處理劑量增加，線性關(guān)系變差，特別是處理劑量較大時，SIF4在較短時間內(nèi)就可對PFK實現(xiàn)較好抑制，如2MIC組處理4 h時，PFK活性降至對照組的76.68%，處理時間延長至8 h和12 h時，抑制活性僅分別增加3.93%和4.05%；PFK是由4個亞基組成的別構(gòu)酶，亞基中除有6-磷酸果糖和ATP結(jié)合位點外，還存在幾個與激活劑(或抑制劑)結(jié)合的別構(gòu)位點，對PFK的抑制作用可能與小分子金抗肽SIF4可競爭性結(jié)合PFK亞基而發(fā)揮別構(gòu)抑制效應(yīng)有關(guān)[13]。

2.1.3 對PK的影響

PK負責催化PEP生成丙酮酸和ATP，是糖酵解最后一個關(guān)鍵酶，pykF和pykA基因可編碼PK同工酶Ⅰ和Ⅱ，以PK I為主[23]。SIF4對PK活性的影響如圖3所示。

圖3 SIF4對丙酮酸激酶的影響Fig.3 The effect of SIF4 on PK

由圖3可知，試驗組與對照組PK活性均存在顯著差異(P<0.05)，1/2MIC、MIC和2MIC組，SIF4處理時間(x)與PK活性(y)呈負相關(guān)關(guān)系，量效線性方程為y=-0.002x+0.181 4(R2=0.846 5)、y=-0.000 3x+0.176 5(R2=0.736 6)和y=-0.005 8x+0.175 0(R2= 0.849 4)，特別是2MIC組，PK活性與處理時間呈良好線性關(guān)系，說明隨著處理時間延長，SIF4對PK抑制活性呈增強趨勢。2MIC組處理4、8、12 h時，PK活性分別降至對照組的75.26%、69.29%和61.31%；PK為別構(gòu)酶，相對分子質(zhì)量為228 kDa，除需要二價金屬離子(Mg2+和Mn2+)外，還需一價金屬離子(K+，Rb+，Cs+)，特別是K+。SIF4對PK抑制作用可能是由于SIF4可競爭性結(jié)合到PK別構(gòu)亞基中發(fā)揮別構(gòu)抑制效應(yīng)，SIF4結(jié)構(gòu)中Fe2+對PK可能存在潛在抑制活性[24]。

2.2 對TCA循環(huán)關(guān)鍵代謝酶的影響

2.2.1 對PDHC的影響

PDHC催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，反應(yīng)不可逆，是關(guān)鍵酶[25]。對PDHC影響如圖4所示。

圖4 SIF4對丙酮酸脫氫酶系的影響Fig.4 The effect of SIF4 on PDHC

由圖4可知，培養(yǎng)4 h時，1/2MIC組與對照組PDHC活性無差異顯著(P>0.05)，培養(yǎng)8～12 h時1/2MIC組與對照組有顯著差異(P<0.05)；MIC和2MIC組與對照組均有顯著差異(P<0.05)。PDHC為多酶復合體，由3種酶[丙酮酸脫氫酶(E1)、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰酶(E2)、二氫硫辛酸脫氫酶(E3)]和6種輔助因子共同組成，PDHC有3個結(jié)構(gòu)域，E1催化的反應(yīng)最慢，催化的不可逆反應(yīng)控制整個反應(yīng)體系速率[25]。由于PDHC為多酶復合體，SIF4對PDHC的具體作用機理還需進一步確認。

2.2.2 對CS的影響

CS能催化乙酰CoA與草酰乙酸縮合生成檸檬酸，是TCA循環(huán)第1個關(guān)鍵限速酶[26]。SIF4對CS的影響如圖5所示。

圖5 SIF4對檸檬酸合成酶的影響Fig.5 The effect of SIF4 on CS

由圖5可知，培養(yǎng)4 h時，1/2MIC與對照組CS無顯著差異(P>0.05)，8～12 h時有顯著性差異(P<0.05)，說明1/2MIC組存在時間依耐，需作用一定時間后對CS的抑制才表現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，而MIC、2MIC組均存在顯著差異(P<0.05)，說明金抗肽SIF4對CS的抑制存在時間或濃度依耐，低劑量組則需要處理一定時間后才表現(xiàn)良好的抑制活性，而高劑量組則在處理4 h就表現(xiàn)出顯著抑制效應(yīng)。因此，金抗肽SIF4應(yīng)用于大腸埃希菌抑菌時，可適當將處理劑量提升到MIC或2MIC，以增強對食源性大腸埃希菌的抑制效果。

2.2.3 對IDH的影響

IDH能不可逆脫下異檸檬酸仲醇上的H而氧化為羰基并生成不穩(wěn)定性中間產(chǎn)物草酰琥珀酸，與酶結(jié)合后快速脫羧生成α-酮戊二酸、NADH和CO2，是第2個關(guān)鍵酶[27]。SIF4對IDH影響如圖6所示。

圖6 SIF4對異檸檬酸脫氫酶的影響Fig.6 The effect of SIF4 on IDH

由圖6可知，各試驗組與對照組IDH活性均存在顯著差異(P<0.05)，但與處理劑量和處理時間有正相關(guān)關(guān)系，處理12 h時，1/2MIC、MIC和2MIC組IDH活性分別為對照組的94.20%、79.58%和73.08%，處理劑量與處理時間存在協(xié)同增強作用。IDH有NAD-依耐型異檸檬酸脫氫酶(NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase，NAD-IDH)和NADP-依耐型異檸檬酸脫氫酶(NADP-dependent isocitrate dehydrogenase，NADP-IDH)2種，催化產(chǎn)生的NADPH和NADH可起到抗氧化脅迫作用，有研究表明，IDH活性降低表明細胞受氧化應(yīng)激損傷越大，對不利環(huán)境耐受性降低[27]。

2.2.4 對α-KGDHC的影響

α-KGDHC催化α-酮戊二酸氧化脫羧反應(yīng)與PDHC催化機理相似，通過磷酸化/去磷酸化來調(diào)節(jié)復合酶系第一步反應(yīng)速率以實現(xiàn)對整個催化效率的調(diào)控[28]，SIF4對α-KGDHC的影響如圖7所示。

圖7 SIF4對α-酮戊二酸脫氫酶系的影響Fig.7 The effect of SIF4 on α-KGDHC

由圖7可知，培養(yǎng)4 h時，1/2MIC組與對照組α-KGDHC 活性差異不顯著(P>0.05)，MIC和2MIC組與對照組有顯著差異(P<0.05)，而培養(yǎng)8～12 h，各試驗組與對照組α-KGDHC活性均存在顯著差異(P<0.05)；研究還發(fā)現(xiàn)，各試驗組α-KGDHC活性隨處理劑量增加和處理時間延長呈明顯降低趨勢，存在協(xié)同增效效應(yīng)[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)ROS體內(nèi)代謝受NADPH所提供質(zhì)子數(shù)量的影響，ROS積累會降低α-KGDH活性，過量ROS會引起菌體慢性缺氧，誘導菌體適應(yīng)性調(diào)節(jié)并使α-KGDH基因表達增強，α-KGDHC是ROS主要靶酶，對氧化應(yīng)激比較敏感，α-KGDH活性和細胞內(nèi)源ROS可作為潛在的細胞氧化應(yīng)激損傷重要的表征指標[29]。

2.2.5 對糖有氧氧化代謝途徑抑制機理分析

以2MIC試驗組為例，SIF4對大腸埃希菌糖代謝抑制活性如圖8所示，

a-EMP；b-TCA圖8 SIF4對糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響Fig.8 The effect of SIF4 on glucose metabolism

由圖8可知，EMP途徑中，SIF4對HK抑制效率最高(66.61%)，其次為PK(39.61%)，PFK抑制率最低(27.37%)，而TCA循環(huán)中，IDH抑制活性最高(26.99%，12 h)，處理8 h時α-KGDHC抑制率為23.44%，處理12 h時PDHC抑制率為25.20%，表明SIF4主要通過抑制糖酵解途徑中HK活性實現(xiàn)對大腸埃希菌的抑菌。總體來說，SIF4對EMP途徑抑制效果要強于TCA循環(huán)，說明EMP途徑是SIF4對大腸埃希菌的主要糖代謝抑制途徑，EMP途徑和TCA循環(huán)中其他葡萄糖氧化代謝關(guān)鍵酶也受到不同程度抑制，說明SIF4對大腸埃希菌抑制是全方位多角度的，這也可能是金抗肽SIF4表現(xiàn)良好抑菌活性的重要原因[29]。

2.3 對細胞質(zhì)膜氧化損傷的影響

2.3.1 對細胞質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化的影響

MDA是細胞質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化氧化損傷主要產(chǎn)物，MDA累積能加速氧化損傷，常作為細胞質(zhì)膜受損特征標志物[30]。SIF4對細胞質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化損傷的影響如圖9所示。

圖9 SIF4對丙二醛含量的影響Fig.9 The effect of SIF4 on MDA content

由圖9可知，試驗組與對照組MDA含量均存在顯著差異(P<0.05)，對照組MDA均保持在較低水平且無顯著增加，說明對照組細胞質(zhì)膜氧化損傷較少；研究發(fā)現(xiàn)，MDA含量與SIF4處理時間和劑量有關(guān)，同一處理劑量組間細胞質(zhì)膜受損程度隨處理時間延長而顯著增長(P<0.05)，而同一處理時間組間細胞質(zhì)膜氧化損傷程度與處理劑量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，作用4、8、12 h，SIF4處理劑量(x)與MDA含量(y)有良好線性關(guān)系，分別為y=0.916 2x+0.159 6(R2=0.915 9)、y=1.248x+0.188(R2=0.893 9)和y=1.223 4x+0.241 8(R2=0.826 5)。有研究表明，微生物可改變細胞膜不飽和脂肪酸比例和含量來調(diào)整質(zhì)膜流動性和抵御逆境，氧化應(yīng)激可影響細胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸比例和含量以及膜流動性[31]，推測SIF4對大腸埃希菌抑菌活性可能與氧化損傷導致細胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸比例、含量以及流動性有關(guān)[29]，SIF4處理能增強細胞質(zhì)膜氧化損傷，當大腸埃希菌細胞暴露在氧化應(yīng)激環(huán)境時，膜內(nèi)不飽和脂肪酸比例會明顯下滑，推斷細胞質(zhì)膜中不飽和脂肪酸是SIF4細胞質(zhì)膜損傷抑菌的重要效應(yīng)靶點之一，與DENICH等[31]一致。

2.3.2 對細胞內(nèi)源ROS生成的影響

細胞內(nèi)源ROS在信號傳導和維持菌體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用，低水平ROS能驅(qū)動細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激并刺激氧化應(yīng)激基因表達特定功能蛋白或保護或修復細胞損傷，但過量ROS可通過降解和變形細胞生物大分子而破壞菌體結(jié)構(gòu)或誘導細胞凋亡，被認為是細胞凋亡的初始因素[32]。DCFH-DA是一種本身無熒光的非標記性的氧化敏感熒光探針，可自由穿梭進入細胞并被胞內(nèi)酯酶水解生成DCFH，DCFH不能自由穿梭透過細胞膜而被裝載于胞內(nèi)，受胞內(nèi)ROS氧化可生成有綠色熒光二氯熒光素(dichlorofluorescein，DCF)，熒光強度與內(nèi)源ROS含量成正相關(guān)[33]。SIF4對細胞內(nèi)源ROS生成影響如圖10所示。

圖10 SIF4對細胞內(nèi)源ROS生成的影響Fig.10 The effect of SIF4 on endogenous ROS

由圖10可知，試驗組與對照組內(nèi)源ROS有顯著性差異(P<0.05)。1/2MIC、2MIC組培養(yǎng)4～12 h時組內(nèi)內(nèi)源ROS產(chǎn)生增幅無顯著性差異，但仍顯著高于對照組(P<0.05)，而MIC組在培養(yǎng)4～12 h時組間有顯著性差異，呈顯著遞增趨勢(P<0.05)，可能是由于1/2MIC組處理劑量太低，對菌體氧化應(yīng)激作用較弱，菌體氧化損傷應(yīng)答不明顯，而2MIC則可能是由于SIF4處理劑量較大，處理4 h時就已對菌體細胞質(zhì)膜造成較為明顯的氧化應(yīng)激損傷，隨后繼續(xù)延長處理時間，氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生的內(nèi)源ROS增幅并不明顯，表明菌體細胞質(zhì)膜氧化損傷已基本接近受損上限[34]，而MIC組胞內(nèi)ROS增長與培養(yǎng)時間延長有明顯關(guān)聯(lián)，可能與MIC組處理劑量適中，對菌體細胞質(zhì)膜的氧化損傷有時間依賴性，因此，菌體氧化應(yīng)激損傷程度隨處理時間延長而顯著增強。有研究認為，菌體細胞質(zhì)膜氧化損傷可誘導細胞產(chǎn)生過量ROS，造成氧化脅迫而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)完整性，并引發(fā)菌體細胞凋亡或程序性死亡[34]，而金抗肽SIF4對菌體細胞膜氧化損傷也可能是其重要的抑菌生化機制。

3 結(jié)論與討論

大腸埃希菌通過葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將葡萄糖轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)并磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，經(jīng)EMP途徑和TCA循環(huán)完成葡萄糖的徹底氧化并生成ATP和中間代謝產(chǎn)物，EMP途徑和TCA循環(huán)是大腸埃希菌最重要的能量代謝途徑，是菌體生命活動的能量基礎(chǔ)，大腸埃希菌作為典型的革蘭氏陰性食源性致病菌，系統(tǒng)研究金抗肽SIF4對其生物抑菌機理有助于理解金抗肽對其他食源性革蘭氏陰性菌的抑菌機理。研究表明，金抗肽SIF4主要通過抑制糖酵解途徑的已糖激酶這一關(guān)鍵酶實現(xiàn)抑菌，對三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶也有抑制活性，但對EMP途徑抑制效果要強于TCA循環(huán)；金抗肽SIF4對菌體細胞質(zhì)膜氧化損傷與處理劑量和處理時間有重要關(guān)聯(lián)，且存在協(xié)同增強效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)膜氧化損傷與胞內(nèi)ROS有密切關(guān)聯(lián)，而ROS生成與胞內(nèi)還原型輔酶提供的氫質(zhì)子數(shù)量有關(guān)[4]，解析葡萄糖生物氧化與細胞質(zhì)膜氧化應(yīng)激對菌體的影響是解析金抗肽SIF4對大腸埃希菌抑菌機理的重要途徑。HK、PFK和PK是EMP途徑催化不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而PDHC、CS、IDH和α-KGDHC是TCA循環(huán)途徑催化不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵酶，監(jiān)測金抗肽SIF4對糖有氧代謝關(guān)鍵酶活性可揭示金抗肽SIF4對大腸埃希菌的非細胞質(zhì)膜損傷機理；課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金抗肽SIF4可破壞菌體細胞膜結(jié)構(gòu)，增強表面疏水性并降低表面zeta電位，造成細胞聚沉，但對細胞質(zhì)膜氧化損傷機理尚不清晰，試驗研究了金抗肽SIF4處理對細胞質(zhì)膜氧化損傷特性標志物——MDA含量變化及胞內(nèi)ROS生成的影響機理，以期解析金抗肽SIF4基于細胞質(zhì)膜損傷的抑菌機理。通過研究基于細胞質(zhì)膜/非細胞質(zhì)膜損傷抑菌機理，為系統(tǒng)闡明金抗肽SIF4對大腸埃希菌的抑菌機理奠定理論基礎(chǔ)。下一步擬研究SIF4對菌體胞內(nèi)蛋白質(zhì)與核酸合成影響機理、與基因組DNA作用機制和對DNA拓撲異構(gòu)酶影響規(guī)律，可為闡明基于胞內(nèi)物質(zhì)代謝調(diào)控的非膜損傷抑菌機理提供進一步實驗依據(jù)。