雙頻超聲輔助酶法改善水產(chǎn)品中重金屬的提取研究

劉馨娜，郝麗玲，徐斐，曹慧，袁敏，葉泰，吳秀秀，陰鳳琴，于勁松，黃椿華

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海，200093)

水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和多種人體必需的微量元素，深受大眾的喜愛。水產(chǎn)品中重金屬殘留超標(biāo)事件頻頻發(fā)生。2021年，國家及各省市市場監(jiān)管局的抽檢數(shù)據(jù)顯示，在包括北京、上海、深圳在內(nèi)的絕大多數(shù)省市均出現(xiàn)食品中重金屬離子超標(biāo)的現(xiàn)象，涉及多個(gè)大型生鮮購買平臺，最高超標(biāo)可達(dá)8倍。由于重金屬具有生物蓄積性[1]，會通過食物鏈直接或間接地進(jìn)入人體內(nèi)，從而對人體造成嚴(yán)重傷害[2]。其中，重金屬Cd(Ⅱ)是水產(chǎn)品中極為典型的重金屬污染物之一，檢出率高，毒性強(qiáng)，即使在很低的暴露濃度下也會對人體肝臟、腎臟等造成損傷[3]。因此，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中鎘的快速檢測十分迫切。

由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性，食品中重金屬離子的前處理技術(shù)在其快速檢測中起著關(guān)鍵性作用，但前處理方法在目前的研究中很容易被弱化[4-5]。目前，食品中重金屬的前處理方法主要有濕法消解、微波消解、壓力罐消解等[6-9]。這幾種前處理方法所需時(shí)間最長可達(dá)12 h，并且需要用到高濃度的酸，對環(huán)境污染極為嚴(yán)重，且與食品安全速測方法的兼容性極差，無法滿足快檢需求。因此建立水產(chǎn)品中重金屬離子快速、高效且綠色的前處理方法十分必要。

研究表明，超聲輔助酶提取法可通過酶解作用，破環(huán)重金屬與食品組分的結(jié)合，同時(shí)利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，促進(jìn)酶作用酶解底物，實(shí)現(xiàn)酶解的加速[10-11]，進(jìn)而大大縮短提取時(shí)間，是一種綠色高效的前處理方法。YILMAZ等[12]，CHENG等[13]，QIN等[14]基于雙頻超聲波裝置輔助酶解的方式實(shí)現(xiàn)了對青蔥中的痕量錳，草藥樣品中的砷，大米樣品中鎘的有效提取。BERMEJO-BARRERA等[15]和PEA-FARFAL等[16]使用雙頻超聲輔助酶解法提取了貽貝樣品中的多種重金屬元素。但由于水產(chǎn)樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，目前報(bào)道的雙頻超聲輔助酶解通常只針對特定水產(chǎn)品(如貽貝)進(jìn)行，不具有普適性，更換水產(chǎn)樣品后，其提取方法可能無法實(shí)現(xiàn)對重金屬離子的有效提取。因此建立水產(chǎn)品及制品中重金屬離子的普適提取方法十分必要。

本研究在建立了牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)雙頻超聲輔助酶解方法的基礎(chǔ)上，僅通過對超聲功率的優(yōu)化，建立了具有一定普適性的水產(chǎn)品中重金屬Cd(Ⅱ)提取方法，可實(shí)現(xiàn)對蟹肉、魷魚、帶魚、皮皮蝦和蝦滑等常見水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取，以期為多種水產(chǎn)品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取分析提供一種綠色高效的提取測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10025)，北京偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院(中國北京)；鎘標(biāo)液，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；風(fēng)味蛋白酶，中國龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶、嗎啉乙磺酸一水合物(2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate，MES)、磷酸二氫銨，上海麥克林生化科技有限公司；帶魚、魷魚絲、蟹肉、皮皮蝦、蝦滑，上海海鮮市場。

1.2 儀器與設(shè)備

SavantAA型原子吸收光譜儀(atomic absorption spectrometer，AAs)，澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司；MARS6型高通量密閉微波消解儀，美國CEM公司；JY92-IIDN型超聲細(xì)胞粉碎儀，寧波山達(dá)生物科技有限公司；L18-Y68S型九陽真空破壁機(jī)，九陽股份有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司。AAs的工作條件見表1。

表1 AAs工作條件Table 1 Operating conditions of AAs

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

實(shí)驗(yàn)中所使用的水產(chǎn)品原材料均通過真空破壁機(jī)粉碎后過80目篩，保存待用。

1.3.2 雙頻超聲輔助酶解提取法

雙頻超聲輔助酶解提取水產(chǎn)品中重金屬Cd(Ⅱ)方法如下：稱取0.6 g樣品粉末或勻漿于10 mL離心管中，加入緩沖溶液，再加入適量的風(fēng)味蛋白酶(5.5×104U/g)和胰蛋白酶(1.7×105U/g)，渦旋振蕩30 s使其混合均勻，然后于37 ℃的超聲儀中水浴超聲6 min，在12 000 r/min的條件下離心10 min，取其上清液，用孔徑為0.45 μm的水系混合濾膜進(jìn)行過濾。再用1%HNO3溶液進(jìn)行倍數(shù)稀釋，并進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

為驗(yàn)證本方法的可靠性，同時(shí)采用國標(biāo)法規(guī)定的水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取方法進(jìn)行對照，方法如下：稱取0.6 g水產(chǎn)品樣品于消解管中，向其中加入適量的HNO3，參考GB 5009.15—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測定》中第一法的微波消解法進(jìn)行消解，并進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)一式三份。其中重金屬Cd(Ⅱ)提取率計(jì)算如公式(1)～公式(4)所示：

(1)

T2=w1×稀釋倍數(shù)

(2)

(3)

T3=w2×稀釋倍數(shù)

(4)

式中：Q1，酶解法重金屬Cd(Ⅱ)提取率，%；T2，酶解上清液中重金屬Cd(Ⅱ)總含量，mg/kg；T1，水產(chǎn)品中重金屬Cd(Ⅱ)總含量，mg/kg；w1，樣品超聲酶解后AAs測得上清稀釋液重金屬Cd(Ⅱ)含量，mg/kg；Q2，微波消解法重金屬Cd(Ⅱ)提取率，%；T3，樣品微波消解法測得重金屬Cd(Ⅱ)總含量，mg/kg；w2，樣品微波消解后石墨爐原子吸收光譜儀測得上清稀釋液重金屬Cd(Ⅱ)含量，mg/kg。

1.3.3 石墨爐原子吸收光譜法測定Cd(Ⅱ)

采用石墨爐原子吸收光譜法通過自動進(jìn)樣器(PAL3000)將10 μL樣品和4 μL基體改進(jìn)劑(10 g/L NH4H2PO4)注入石墨管中，以進(jìn)行分析。使用鎘空心陰極燈作為Cd(Ⅱ)測定時(shí)的輻射源，其燈電流為3.0 mA，波長為283.3 nm，狹縫寬度為0.5 nm，氬氣輸出壓力為0.30 MPa左右。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

本研究采用雙頻超聲輔助酶解法提取水產(chǎn)品及其制品中的重金屬Cd(Ⅱ)。由于緩沖溶液的種類、蛋白酶酶量、pH值、料液比和超聲條件對重金屬Cd(Ⅱ)的提取會產(chǎn)生不同的影響，所以實(shí)驗(yàn)研究了樣品在不同提取條件下的提取效率，并使用傳統(tǒng)的微波消解法作為對照，從而確定出了重金屬Cd(Ⅱ)提取的最佳條件。

2.1.1 超聲模式優(yōu)化

超聲波可基于空化效應(yīng)顯著加快酶解過程，因此首先研究了超聲模式對水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結(jié)果如圖1所示，在單獨(dú)使用超聲探頭、單獨(dú)使用超聲水浴以及聯(lián)合使用超聲探頭和超聲水浴(雙頻超聲)3種模式下，使用雙頻超聲模式時(shí)，重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高可達(dá)82.63%。表明雙頻超聲模式最適合用于牡蠣樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。這可能是由于雙頻超聲要比單頻超聲具有更寬的頻率范圍，因此可以擁有更好的空化效果，這種空化效果可能促進(jìn)了超聲能量傳輸，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)促進(jìn)更多的重金屬Cd(Ⅱ)釋放到溶液中[17]。

圖1 超聲模式對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.1 Influence of ultrasonic mode on oncadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.2 緩沖溶液種類優(yōu)化

緩沖溶液具有維持溶液體系pH值相對穩(wěn)定的性能，使得pH值在一定的范圍內(nèi)不因稀釋或外加少量的酸或堿而發(fā)生顯著變化，這對于酶活性的發(fā)揮具有重要作用。本研究對PB、HEPES、MES、Tris 4種緩沖溶液進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖2所示，在其他實(shí)驗(yàn)條件保持固定的情況下，與其他3種緩沖溶液相比，使用Tris緩沖作為本研究的緩沖溶液時(shí)，牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率可以達(dá)到65.13%，具有最佳提取效果。

圖2 緩沖溶液種類對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.2 Influence of buffer solution types on cadmium (Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.3 酶配方優(yōu)化

牡蠣樣品中蛋白質(zhì)含量豐富，而且重金屬Cd(Ⅱ)主要是和蛋白質(zhì)上的巰基進(jìn)行結(jié)合[18-19]。風(fēng)味蛋白酶與胰蛋白酶的復(fù)配可以有效破壞重金屬Cd(Ⅱ)與蛋白質(zhì)之間的配位結(jié)合，使得重金屬Cd(Ⅱ)從蛋白質(zhì)上釋放。因此選用蛋白酶對牡蠣中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解破壞其結(jié)構(gòu)，促使重金屬從蛋白質(zhì)上更好地解離下來。固定胰蛋白酶的添加量為0.3 g，改變風(fēng)味蛋白酶的添加量，以實(shí)際提取率與重金屬Cd(Ⅱ)理論提取率(100%)的差值最小為優(yōu)化指標(biāo)。隨著風(fēng)味蛋白酶酶量的增加，實(shí)際提取率與重金屬Cd(Ⅱ)理論提取率的差值呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶的添加量為0.7 g時(shí)，重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為98.16%，其與理論提取率的差值最小，為1.84%。這可能是由于蛋白酶酶量不足時(shí)，底物與酶不能完全結(jié)合，蛋白酶酶量過多時(shí)，則會抑制底物的水解。因此，本實(shí)驗(yàn)選用的酶配方為0.3 g胰蛋白酶與0.7 g風(fēng)味蛋白酶的復(fù)配。

圖3 酶配方對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.3 Influence of enzyme formulation on cadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.4 pH值優(yōu)化

酶的生物活性受到提取劑pH值的影響較大，不適合的pH值會使酶變性失活[20]。在綜合考慮風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH值后，按照1.3.2的實(shí)驗(yàn)方法，考察了所用緩沖溶液的pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時(shí)牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，重金屬Cd(Ⅱ)的提取率達(dá)到103.2%，與理論提取率的差值最小，僅為3.2%。因此本實(shí)驗(yàn)選用7.0作為溶液的pH值。

圖4 pH值對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.4 Influence of pH on cadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.5 料液比優(yōu)化

樣品和酶在溶液中的分散性會影響牡蠣中鎘的提取率，因此本研究考察了不同料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，g∶mL)對牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率的影響。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)料液比為1∶5(g∶mL)時(shí)，重金屬Cd(Ⅱ)提取率為104.76%，與理論提取率的差值最小，僅為4.76%。這可能是由于料液比過低時(shí)，樣品和酶在溶液中的分散性較差，不利于復(fù)合酶酶解作用的發(fā)揮；料液比過高時(shí)，蛋白酶被稀釋，酶活性下降，不利于重金屬Cd(Ⅱ)的提取。因此，本研究選在1∶5(g∶mL)的料液比下開展實(shí)驗(yàn)。

圖5 料液比對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.5 Influence of solid-liquid ratio on cadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

對牡蠣樣品的超聲模式、緩沖種類、酶量、pH值以及料液比進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，牡蠣樣品的最佳提取條件為：緩沖溶液為Tris溶液，0.7 g風(fēng)味蛋白酶與0.3 g胰蛋白酶為復(fù)合酶配方，pH值為7，料液比為1∶5(g∶mL)，此時(shí)重金屬Cd(Ⅱ)的提取率可以達(dá)到104.76%。

2.2 水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的普適性提取條件

除牡蠣外，蟹肉、帶魚、魷魚絲、皮皮蝦和蝦滑也常出現(xiàn)重金屬鎘超標(biāo)的情況，且被廣泛食用，因此本研究以這5種具有代表性的水產(chǎn)品及其制品為例，進(jìn)行水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的普適性提取條件研究。利用鎘標(biāo)液對上述5種樣品進(jìn)行加標(biāo)，混勻后置于室溫下靜置30 min，在上述最佳提取條件的基礎(chǔ)上，考察不同的超聲探頭功率(10%、15%、20%、25%、30%)對5種樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。

2.2.1 超聲功率對蟹肉中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標(biāo)的蟹肉樣品于離心管中，在僅改變超聲功率不改變其他實(shí)驗(yàn)條件的情況下，計(jì)算樣品的提取率和與理論提取率的差值。在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，研究超聲探頭的不同功率對蟹肉樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)超聲功率為25%時(shí)，蟹肉樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為100.39%，與理論提取率的差值僅為0.39%。說明，在上述最優(yōu)提取條件下，僅需將超聲探頭功率調(diào)至25%即可實(shí)現(xiàn)對蟹肉中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖6 超聲探頭功率對蟹肉中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.6 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate in crab meat

2.2.2 超聲功率對帶魚中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標(biāo)的帶魚樣品于離心管中，在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，研究超聲探頭的不同功率對帶魚樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)超聲功率為30%時(shí)，帶魚樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為84.51%，與理論提取率的差值為15.49%。說明，在上述最優(yōu)提取條件下，僅需將超聲探頭功率調(diào)至25%即可實(shí)現(xiàn)對帶魚中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖7 超聲探頭功率對帶魚中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.7 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate from hairtail

2.2.3 超聲功率對魷魚絲中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標(biāo)的魷魚絲樣品于離心管中，在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，研究超聲探頭的不同功率對魷魚絲樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結(jié)果如圖8所示，當(dāng)超聲功率為15%時(shí)，魷魚絲樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為75.66%，與理論提取率的差值為24.34%。說明，在上述最優(yōu)提取條件下，僅需將超聲探頭功率調(diào)至15%即可實(shí)現(xiàn)對魷魚絲中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖8 超聲探頭功率對魷魚絲中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.8 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate from squid silk

2.2.4 超聲功率對皮皮蝦中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標(biāo)的皮皮蝦樣品于離心管中，在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，研究超聲探頭的不同功率對皮皮蝦樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結(jié)果如圖9所示，當(dāng)超聲功率為10%時(shí)，皮皮蝦樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為93.18%，與理論提取率的差值為6.82%。說明，在上述最優(yōu)提取條件下，僅需將超聲探頭功率調(diào)至10%即可實(shí)現(xiàn)對皮皮蝦中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖9 超聲探頭功率對皮皮蝦中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.9 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate from shrimps

2.2.5 超聲功率對蝦滑中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標(biāo)的蝦滑樣品于離心管中，在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，研究超聲探頭的不同功率對蝦滑樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結(jié)果如圖10所示，當(dāng)超聲功率為10%時(shí)，蝦滑樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為94.97%，與理論提取率的差值為5.03%。說明，在上述最優(yōu)提取條件下，僅需將超聲探頭功率調(diào)至10%即可實(shí)現(xiàn)對蝦滑中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖10 超聲探頭功率對蝦滑中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.10 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate in shrimp slippage

2.3 水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的測定

采用優(yōu)化好的前處理及檢測方法，對市售的水產(chǎn)品及其制品(牡蠣，蟹肉，帶魚，魷魚絲，皮皮蝦以及蝦滑)中的重金屬Cd(Ⅱ)進(jìn)行測定。并與微波消解法的測定值相比較，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，水產(chǎn)品牡蠣，蟹肉，帶魚，魷魚絲，皮皮蝦以及蝦滑重金屬Cd(Ⅱ)提取率均在75%～110%。相較傳統(tǒng)的微波消解法，雙頻超聲輔助酶提取水產(chǎn)品中重金屬的前處理方法用酸量少、耗時(shí)短且反應(yīng)過程溫和，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，用于水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取具有一定的普適性。

表2 水產(chǎn)樣品測定結(jié)果(n=3)Table 2 Determination results of aquatic samples (n=3)

3 結(jié)論

通過研究不同超聲模式，緩沖溶液，酶配方，pH值以及料液比對牡蠣樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率的影響，得到牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的最佳提取條件：以Tris作為緩沖溶液，以0.7 g風(fēng)味蛋白酶與0.3 g胰蛋白酶為復(fù)合酶配方，pH值為7，料液比為1∶5(g∶mL)，可在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的高效提取，其提取率可達(dá)104.76%。在上述最佳提取條件下，僅需改變超聲功率即可獲得水產(chǎn)品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的普適提取方法，實(shí)現(xiàn)了對蟹肉，帶魚，魷魚絲，皮皮蝦和蝦滑中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取，其提取率可達(dá)75%～110%。與傳統(tǒng)的微波消解法相比，該方法借助超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)輔助酶水解，大大縮短了提取時(shí)間，同時(shí)采用的溶液pH為中性，環(huán)境友好且與速測方法具有良好的兼容性，在水產(chǎn)品及其制品中重金屬前處理及快速檢測領(lǐng)域應(yīng)用前景十分廣闊。