膜分離制備中國毛蝦多肽及滋味評價

惠婷婷，楊志艷，祝寶華，李燕,2,3，李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品及加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海，201306)

中國毛蝦(Aceteschinensis)，也叫毛蝦，小白蝦，是一種高營養(yǎng)價值的海洋低值蝦類。據(jù)統(tǒng)計，我國2020年毛蝦捕撈量達(dá)36.7萬t，占蝦捕撈量的30.45%，位列第一[1]。新鮮毛蝦含水量達(dá)80%以上，體小皮薄，不易加工，大多制作成蝦皮、蝦醬以及用于飼料生產(chǎn)，產(chǎn)品加工方法單一，附加值低。

呈味肽通常是由氨基酸合成或酶水解產(chǎn)生，分子質(zhì)量<3 000 Da，呈現(xiàn)出酸味、咸味、苦味、甜味和鮮味[2]。以水產(chǎn)動物蛋白為原料，采用酶水解技術(shù)使蛋白質(zhì)降解為具有呈味特性的短肽和氨基酸，是近年來研究的熱點(diǎn)[3]。張典[4]使用復(fù)合酶酶解牡蠣，得到酶解液進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)具有鮮味肽和酸味肽，將鑒定出的肽段合成并加入食鹽溶液中起到鮮味增強(qiáng)作用。國內(nèi)曹文紅等[5]最早使用蛋白酶對毛蝦進(jìn)行酶解，并對酶解液血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin I-converting enzyme，ACE)抑制活性和抗氧化性進(jìn)行研究。毛蝦酶解的研究主要集中在生物活性肽生產(chǎn)、水解工藝的優(yōu)化等，利用毛蝦制備呈味肽研究甚少。毛蝦水解后產(chǎn)生的小分子肽和游離氨基酸，賦予酶解液一定的風(fēng)味，因此可作為制備天然調(diào)味品的理想基料。

酶法制備蛋白水解液具有較明顯的苦味，從而影響了酶解產(chǎn)物被進(jìn)一步加工和開發(fā)多肽產(chǎn)品。據(jù)文獻(xiàn)報道，蛋白酶解液之所以產(chǎn)生苦味，是由于蛋白質(zhì)經(jīng)水解埋藏在其內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露，與味蕾接觸產(chǎn)生苦味[6]。目前蛋白水解物中不良性風(fēng)味的脫除方法主要有選擇性分離法、掩蓋法和酶解法等[7]，其中膜分離屬于選擇性分離法。膜分離技術(shù)操作方便，污染小，耗能小，不僅可以去除酶解液中的大分子和無機(jī)鹽[8]，還能達(dá)到除雜、脫色和脫苦的作用，在活性肽分離純化方面廣泛應(yīng)用。熊文飛等[9]利用500 u納濾膜將杏鮑菇酶解液中氨基酸、核苷酸等呈味物質(zhì)與苦味肽分離，脫苦效果良好。汪濤等[10]以扇貝邊為原料，使用幾種蛋白酶酶解，所得酶解液經(jīng)過超濾透過和反滲透截留，濃縮液苦味、腥味減少，海鮮風(fēng)味提升。

為提高毛蝦的利用率，本文使用酶法水解中國毛蝦，并對膜分離制備毛蝦多肽的工藝進(jìn)行研究。采用電子舌對毛蝦酶解液和膜分離組分的滋味進(jìn)行評價，結(jié)合感官分析對膜分離得到的不同組分的苦味進(jìn)行分析。以期為中國毛蝦多肽的風(fēng)味提升提供技術(shù)支持，同時為制備風(fēng)味良好的高值營養(yǎng)食品提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國毛蝦，購自浙江舟山，冷凍運(yùn)輸回實驗室，-20 ℃冷凍保存。

堿性蛋白酶(60 000 U/g)，天津諾奧有限公司；鹽酸、H2SO4、1-苯胺基-8-萘磺酸、檸檬酸鈉、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·H2O、K2SO4、CuSO4·5H2O(化學(xué)純)，中國國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

800Y 304不銹鋼粉碎機(jī)，歐橡；HJ-4A恒溫多頭磁力攪拌器，江蘇科析儀器；LYNX 4 000高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher；ASTREE電子舌，法國Alpha MOS；CHRIST ALPHA1-2真空冷凍干燥機(jī)，德國Marin Christ；RNM-18G多功能膜實驗設(shè)備，杭州瑞納膜；KJELTEC 8400全自動凱氏定氮儀，蘇州福斯賽諾分析儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 基本營養(yǎng)成分測定和氨基酸組分測定

水分、灰分、粗蛋白、脂肪含量測定參照GB 5009.3～6—2016?？偺呛繙y定參照硫酸-苯酚比色法[11]。氨基酸組分測定參照GB 5009.124—2016。

1.3.2 中國毛蝦酶解液的制備及膜分離

毛蝦解凍后，用粉碎機(jī)打成蝦糜，按照前期酶解工藝優(yōu)化條件，以1∶4(g∶mL)的料液比，添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))堿性蛋白酶，55 ℃酶解3 h，90 ℃ 15 min滅酶，得到毛蝦酶解液。同時以未加酶組為對照組。

15 L毛蝦酶解液先使用尼龍膜去除蝦渣。分別經(jīng)過0.2 μm陶瓷膜、3 000 Da超濾膜、150 Da納濾膜多級膜分離過濾，得到相應(yīng)的透過液和截留液，取樣進(jìn)行分析。具體膜分離具體參數(shù)見表1。膜分離工藝流程如圖1所示。

表1 膜分離運(yùn)行工藝參數(shù)Table 1 Membrane separation process parameters

圖1 中國毛蝦酶解液的膜分離工藝Fig.1 Membrane separation process of Acetes chinensis hydrolysate

1.3.3 固形物回收率

參照程緣等[12]的方法計算膜過濾后濾過液的固形物回收率，以此檢驗?zāi)さ耐ㄍ感阅?。如公?1)所示：

(1)

式中：C0，膜過濾前糖度，°Bx；V0，膜過濾前酶解液體積，L；C1，濾過液糖度，°Bx；V1，濾過液體積，L。

1.3.4 多肽含量測定

采用三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)-雙縮脲法測定[13]。以5% TCA配制標(biāo)準(zhǔn)多肽溶液，并取3 mL，加入3 mL 0.1 g/mL NaOH溶液以及1 mL 0.01 g/mL CuSO4溶液，混勻后靜置10 min，在540 nm處吸光值。以多肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，吸光值為縱坐標(biāo)Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。制得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.053 7x，R2=0.996。

1.3.5 滋味分析

參照邴芳玲等[14]的方法，利用Astree電子舌系統(tǒng)對樣品檢測，此系統(tǒng)包括AHS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS、PKS，其中 AHS、CTS、NMS分別代表酸味、咸味、鮮味，其他都是通用。取相同質(zhì)量濃度的酶解液20 mL，水浴加熱到50 ℃，進(jìn)行電子舌測定，每個樣品重復(fù)測定7次，數(shù)據(jù)采集時間為180 s，以超純水為清洗溶液清洗20 s。儀器軟件取第120 s測量值的響應(yīng)信號作為穩(wěn)定數(shù)據(jù)區(qū)域的輸出值，取最后3次測量的響應(yīng)值作為統(tǒng)計分析的原始數(shù)據(jù)，取平均值進(jìn)行分析。

1.3.6 疏水性測定

參考WANG等[15]的方法，用熒光分光光度計RF-5301PC熒光探針測定蛋白水解物表面疏水值。將各組分凍干粉用0.01 mol/L、pH 6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，取2 mL上述溶液，加入10 μL ANS，混勻。激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm。以多肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，表面疏水值為縱坐標(biāo)Y，對濃度進(jìn)行線性回歸分析y=kx+b, 以斜率k作為表面疏水性指數(shù)。

1.3.7 苦味感官評價

苦味評分標(biāo)準(zhǔn)參考樂彩虹等[16]的方法稍作修改：將咖啡因配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.025%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%的溶液，其對應(yīng)的苦味程度和評分值如表2所示。按此評分標(biāo)準(zhǔn)，選取20名經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)后的同學(xué)(10男 10女)品嘗酶解液的苦味，并與標(biāo)準(zhǔn)液比較進(jìn)行評分，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)的分值對樣品進(jìn)行對照打分(0～10分)，取平均值表示苦味分值。

表2 苦味感官評分表Table 2 The table of bitter taste sensory score

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗平行3次進(jìn)行。數(shù)據(jù)由Orign 9.0軟件繪制。采用SPSS 20.0版軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國毛蝦基本營養(yǎng)成分

中國毛蝦基本營養(yǎng)成分如表3所示，可見中國毛蝦粗蛋白含量高、脂肪和總糖含量低，含有一定的灰分。中國毛蝦蛋白質(zhì)的氨基酸組成如表4所示，可以看出中國毛蝦的氨基酸種類比較齊全。中國毛蝦蛋白的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)/總氨基酸(amino acid,AA)為0.39，EAA/非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)為0.63，可見中國毛蝦是一種較為理想的蛋白質(zhì)來源。含量居前兩位的是谷氨酸和天冬氨酸，含量分別為(8.31±0.38)g/100g和，為(5.56±0.23)g/100g，精氨酸含量次之，為(5.32±0.22)g/100g。

不同的氨基酸與滋味密切相關(guān)。游離谷氨酸、天冬氨酸和由谷氨酸、天冬氨酸和親水性氨基酸殘基組成的小分子肽具有強(qiáng)烈的鮮味。蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸具有甜味[17]。疏水氨基酸及其組成的肽段具有苦味。如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等，若疏水基團(tuán)位于肽鏈C端會使苦味增強(qiáng)。毛蝦蛋白氨基酸組成中鮮味、甜味和苦味氨基酸占總氨基酸含量分別為24%、22%和28%，可見中國毛蝦蛋白酶解后會釋放游離氨基酸和小分子肽，使酶解液具有鮮味、甜味，也會產(chǎn)生苦味。

表3 中國毛蝦基本營養(yǎng)成分 單位：g/100g

表4 中國毛蝦蛋白質(zhì)的氨基酸組成 單位：g/100g

2.2 膜分離制備毛蝦多肽

中國毛蝦經(jīng)過酶解后，產(chǎn)生不同分子質(zhì)量的多肽和氨基酸。膜分離可以去除大分子不溶物，同時截留相應(yīng)的毛蝦多肽。糖度即表示固形物含量，各組分經(jīng)過膜處理后固形物和顏色的變化如表5和圖2所示。原毛蝦酶解液經(jīng)陶瓷膜過濾后，顏色澄清，呈現(xiàn)棕紅色，固形物回收率為(68.09±1.56)%，固形物回收率下降較多，說明去除了大量酶解后的不溶性物質(zhì)。經(jīng)過超濾膜3 000 Da過濾后，顏色變?yōu)闇\黃色，固形物回收率為(56.74±0.90)%，超濾膜對色素有去除效果，截留組分固形物較少，說明超濾分子質(zhì)量<3 000 Da 透過液組分大多是由小分子多肽和氨基酸組成。經(jīng)納濾膜150 Da過濾后得到的截留組分，體積1.8 L，體積濃縮比(volume concentration ratio，VCR)為6.67，固形物回收率為(51.06±1.34)%，截留液出現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明納濾濃縮效果良好。納濾處理前后，納濾截留液>150 Da的固形物保留了90%，說明較好的保留了毛蝦酶解液多肽組分。納濾透過液顏色變?yōu)闊o色，固形物含量較少。與張曉瑜等[18]用陶瓷膜微濾馬氏珠母貝肉酶解液結(jié)論所得陶瓷膜過濾能改善酶解液的色值和澄清度一致。

最后得到納濾截留液和原酶解液經(jīng)噴霧干燥后，進(jìn)行毛蝦多肽含量和理化指標(biāo)測定，納濾截留液的多肽含量[(70.75±0.35) g/100g]及總氮含量[(13.95±0.05) g/100g]與原酶解液比都略有提升。納濾截留液的灰分為(2.67±0.02) g/100g，與毛蝦原料相比，大大降低，且其水分和游離氨基酸含量分別為(5.28±0.02) g/100g和(14.64±0.27) g/100g，均達(dá)到GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》的標(biāo)準(zhǔn)。毛蝦水解后產(chǎn)生較多的游離氨基酸，推測毛蝦多肽粉具有較高鮮味，后續(xù)對毛蝦多肽粉的滋味進(jìn)行電子舌分析。

表5 膜分離組分固形物含量和理化分析Table 5 Solid content and physicochemical analysis of membrane separation components

圖2 不同組分膜過濾液Fig.2 Different components of membrane filtrate注：從左到右依次為納濾透過液、納濾截留液、超濾透過液、 超濾截留液、陶瓷膜透過液和陶瓷膜截留液

2.3 中國毛蝦酶解液電子舌滋味分析

電子舌是一種簡便、快捷且新穎的滋味分析檢測技術(shù)，目前受到了廣泛關(guān)注和研究[14,19]。為直觀表達(dá)中國毛蝦酶解液的滋味變化，將電子舌檢測結(jié)果根據(jù)強(qiáng)度值進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，與不加酶對照組相比，毛蝦酶解液的酸度和鮮度增加，酸度推測是與谷氨酸、天冬氨酸的含量增加有關(guān)。鮮味主要由于酶解液中鮮味游離氨基酸或鮮味肽所致。咸味下降，說明毛蝦酶解液整體的滋味發(fā)生變化。

膜分離各組分的滋味變化比較明顯，鮮味響應(yīng)值由原酶解液6.7提高至納濾截留液9.9，而咸味響應(yīng)值從6.1下降到4.2，可見膜分離改變毛蝦酶解液組成。咸味與氨基酸的種類和組成有關(guān)[20]，另外膜分離技術(shù)具有脫鹽的作用[8,21]，這與之前測定灰分含量下降結(jié)果一致。與超濾截留液相比，納濾150 Da去除氨基酸等小分子后的截留液鮮味增加依然非常明顯，推測鮮味與小分子肽有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)Gly-Asp、Ala-Glu、Glu-Leu等小分子肽均具有鮮味[22]。因此對納濾截留液的多肽鑒定可能發(fā)現(xiàn)新的滋味肽。

圖3 中國毛蝦酶解液和膜分離組成電子舌分析Fig.3 E-tongue value of Acetes chinensis hydrolysate and membrane separation fractions

2.4 膜分離組分的疏水性和苦味分析

在蛋白質(zhì)酶解過程中，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，疏水性升高，隨著酶解的進(jìn)行，表面疏水性下降，主要是由于更多的親水氨基酸暴露于表面[23]。水解物的苦味主要由原先包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性片段水解而被暴露出來，與人體苦味受體結(jié)合而被感知，因此疏水性與苦味有著重要關(guān)聯(lián)。疏水性指數(shù)越大，苦味越強(qiáng)[24]。

由表6可知，經(jīng)膜處理后的酶解液疏水性指數(shù)明顯下降。陶瓷膜截留液的分子質(zhì)量最大，疏水性指數(shù)最大，納濾透過液的分子質(zhì)量最小，疏水性指數(shù)最小，每種膜處理后截留液比相應(yīng)的透過液分子質(zhì)量大，疏水性指數(shù)大于相應(yīng)的透過液，說明蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小影響疏水性。程緣等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨著超濾的進(jìn)行，其中分子質(zhì)量> 10 kDa組分的表面疏水性最大(P<0.05)，而分子質(zhì)量3～10 kDa的組分有所下降。分子質(zhì)量>10 kDa和<3 kDa的組分疏水性均有所增大，本研究結(jié)果與之相似。

由于電子舌無法判別苦味信息，因此對樣品苦味進(jìn)行感官評價。由表6可知，毛蝦酶解液苦味一般、膜過濾后陶瓷膜截留液苦味極重。納濾截留液樣品的苦味比酶解液增加，納濾透過液苦味評分最低，完全沒有苦味。說明疏水性與苦味感官有一定的關(guān)系。由烷基側(cè)鏈和芳香性側(cè)鏈組成的疏水性氨基酸造成了苦味肽的苦味，苦味肽中至少含有一個疏水性氨基酸。另外疏水性氨基酸在肽鏈的位置也與苦味有關(guān)，疏水性氨基酸殘基在多肽兩側(cè)，則苦味增強(qiáng)[25]。解銘[24]對鱈魚酶解液進(jìn)行疏水性測定，得到疏水性指數(shù)最大和最小值分別為250和60，苦味強(qiáng)度跟隨疏水性指數(shù)增大而增大，本文疏水性指數(shù)均小于解銘的研究結(jié)果。進(jìn)一步表明毛蝦酶解多肽具有較好的滋味和較弱的苦味，有一定應(yīng)用價值。

表6 膜分離組分酶解液的疏水性指數(shù)Table 6 Hydrophobicity index of hydrolysate of membrane separation components

3 結(jié)論

本研究對中國毛蝦的基本營養(yǎng)成分及氨基酸組成進(jìn)行測定，其粗蛋白含量較高為(75.85±0.19) g/100g(干基)，且富含多種呈味氨基酸，其鮮味、甜味和苦味氨基酸分別占總氨基酸含量的(24±0.00)%、(22±0.02)%和(28±0.00)%。使用酶法制備中國毛蝦酶解液，并利用多級膜分離系統(tǒng)制備毛蝦多肽粉，發(fā)現(xiàn)毛蝦酶解后鮮味和酸味強(qiáng)度增加，咸味下降；膜分離得到酶解液的鮮味提升明顯，咸味降低。膜分離組分的疏水性指數(shù)明顯降低。膜分離能夠高效制備獲得較好滋味的毛蝦多肽粉，為工業(yè)化生產(chǎn)毛蝦多肽，提高毛蝦資源利用率和產(chǎn)品附加值提供參考。本文后續(xù)將對毛蝦納濾組分中的小分子肽進(jìn)行分離鑒定，以期為風(fēng)味肽的研究開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。