乳酸菌乙醇脅迫的應答機制研究進展

雍霖宣， 王曉丹， 舒伯精， 邱樹毅， 班世棟*

1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025;3.貴州莊稼漢薏米產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司,貴州 黔西南州 561412

乳酸菌是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、無芽孢，并且能發(fā)酵多種糖類物質，終產(chǎn)物為乳酸的一類細菌總稱[1]。具有促進人體健康和增加人體營養(yǎng)的功能，被認為是益生菌并用于食品工業(yè)[2]。乳酸菌具有一定的功能性，廣泛應用于食品生產(chǎn)行業(yè)，目前有關乳酸菌發(fā)酵的食品種類多達120多種[3]。另外乳酸菌還被應用于醫(yī)藥與健康產(chǎn)業(yè)，作為益生菌有一定的臨床應用效果[4-5]。在農(nóng)牧水產(chǎn)和養(yǎng)殖業(yè)方面，也得到應用，乳酸菌發(fā)揮越來越大的作用于現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[6-7]。在工業(yè)上通過乳酸菌代謝，可以獲得高附加價值的產(chǎn)物[8-9]。乳酸菌具有多樣性，根據(jù)有關研究報道，乳酸菌屬于：厚壁菌門，包含4綱7目18科39屬，包括653個種；放線菌門包含2綱2目3科12屬，至少88個種[10]。所以乳酸菌種類繁多，且較為廣泛地應用于我們的生產(chǎn)生活(圖1)。

圖1 乳酸菌在人類社會實踐中的應用

乳酸菌作為食品中的發(fā)酵劑，扮演著重要角色，對產(chǎn)品風味和質地的形成及改善發(fā)揮著重要作用[11]。然而乳酸菌在食品發(fā)酵過程中會遇到對其生長不利的條件，比如乙醇脅迫，對乳酸菌的代謝活動和生產(chǎn)效率產(chǎn)生不利影響[12-13]。在傳統(tǒng)中國白酒釀造過程中，窖池中乳酸菌發(fā)酵7 d后便成為優(yōu)勢細菌；隨著發(fā)酵的進行，酵母代謝產(chǎn)生乙醇；在整個發(fā)酵體系中，環(huán)境的乙醇濃度逐漸增加，乳酸菌生長受到抑制，逐步衰亡[14-15]。但在發(fā)酵中后期，部分乳酸菌逐漸適應不利的環(huán)境，繼而出現(xiàn)耐受較高乙醇濃度的乳酸菌，后續(xù)發(fā)酵過程產(chǎn)生乙酸、乳酸等代謝產(chǎn)物，對白酒的風味做出貢獻。

面對外界環(huán)境脅迫，乳酸菌具有一定的適應機制，包括基因和蛋白質表達的變化[16-17]。乳酸菌種類繁多與人類生活息息相關，本文通過介紹乳酸菌受到乙醇脅迫后的表現(xiàn)，對細胞形態(tài)、膜組分、酶活性的變化以及代謝的影響，總結其乙醇耐受機理，旨在為更好的了解乳酸菌科學，加快乳酸菌在人類生產(chǎn)生活中的應用，為乳酸菌乙醇脅迫應答機制的研究和優(yōu)良菌株的選育提供參考。

1 乙醇脅迫對乳酸菌的生理特征及代謝影響

1.1 對生理特征的影響

乳酸菌廣泛運用于乳制品、果蔬制品、酒精飲料、面制品等發(fā)酵食品。在傳統(tǒng)中國白酒釀造過程中，乳酸菌是重要的細菌，尤其是在白酒發(fā)酵中后期，乳酸菌由于其耐受較高乙醇濃度等惡劣生長環(huán)境，從而成為絕對優(yōu)勢細菌[18]。乳酸菌代謝生成乳酸和乙酸，是白酒風味的重要組成，對其他釀造微生物的生長產(chǎn)生影響，繼而影響整個發(fā)酵過程，是白酒釀造過程中重要的功能微生物。

在食品生產(chǎn)加工過程中，乳酸菌不可避免的受到各種環(huán)境脅迫，對其生長產(chǎn)生不利影響。其中乙醇脅迫較為常見，乙醇對細菌的傷害一般歸因于等離子體的干擾，破壞細胞膜完整性[19]。研究表明，5%體積分數(shù)的乙醇便能抑制乳酸菌的生長速度[20]。乙醇體積分數(shù)為8%～10%的條件下其生長會受到明顯抑制[21]。12%體積分數(shù)以上的乙醇濃度不僅抑制細菌的生長，引發(fā)代謝異常，細胞膜褶皺和破裂，膜結構遭到破壞，嚴重影響了細胞膜功能性和通透性，甚至造成菌體的大量死亡[22]。乙醇會影響微生物細胞膜組成、結構和流動性[23]，其作為有機溶劑對乳酸桿菌的毒性主要表現(xiàn)在細胞膜的破壞上，乙醇滲透到細胞膜可以改變膜結構，破壞膜完整性，抑制膜功能，影響細菌代謝的關鍵酶活性，從而降低細菌存活率。

1.1.1細胞形態(tài)發(fā)生變化

當乳酸菌遭遇乙醇脅迫，隨著乙醇濃度的增加，如圖2所示，經(jīng)過8%乙醇脅迫后(2 d)掃描電鏡下可以發(fā)現(xiàn)細胞表面變得粗糙和折疊，甚至破裂導致內含物流出[24]。CHEN等人的研究表明，隨著乙醇濃度增加到6%及以上，細胞形態(tài)變化較為明顯，細胞破碎且外圍變得模糊，細胞之間相互聚集并粘附在一起[25]。

圖2 乙醇脅迫后乳酸菌細胞形態(tài)變化

較高濃度的乙醇脅迫會導致細胞膜組成成分受損，損害細胞膜完整性；對代謝產(chǎn)生負面影響，繼而降低細胞的生存能力。KIM等人通過測量釋放的O-硝基酚的熒光強度來確定乙醇對細胞膜的破壞能力[26]。其主要原理是，β-半乳糖酶是細菌的內源性酶，只有當細胞膜受損后才會釋放到細胞外；β-半乳糖酶可分解形成O-硝基酚，其最大吸收峰值為420 nm，所以在420 nm的熒光分光光度計下測量可以得知乙醇對細胞膜的破壞程度[25]。

這些研究表明乳酸菌在面臨一定濃度的乙醇脅迫后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞折疊甚至破碎。

1.1.2細胞膜組分發(fā)生變化

乳酸菌細胞壁主要成分是肽聚糖和磷壁酸以及少量的類脂體。這些含量不多的脂質成分，通常是不飽和脂肪酸，往往影響著細胞膜的流動性[27]。較長的脂肪酸鏈更容易穿過細胞膜,促進?；溙畛?并使膜環(huán)境更像凝膠狀,通過減小游離?；溎┒说倪\動以降低膜的流動性和不穩(wěn)定性[28]。膜流動性降低，使細胞對乙醇的滲透性降低，從而在一定程度上提高了對乙醇的耐受能力[29-30]。有關研究表明，從葡萄酒中分離出的乳酸菌，在不同發(fā)酵時期面臨不同的乙醇濃度，可以自主調節(jié)膜脂質組成[31]。

DA SILVEIRA MG等人研究表明隨著乙醇濃度增加，細胞中脂肪酸的不飽和程度也相應增加[32]。這與BONOMO MG等人的研究結果相一致即乳酸菌細胞膜的組成會受到乙醇脅迫的影響而發(fā)生變化，表現(xiàn)在細胞中不飽和脂肪酸的比例增加[33]。

乳酸菌面臨乙醇脅迫發(fā)生的一系列連鎖反應，改變了細胞膜物理和化學狀態(tài)，即不飽和脂肪酸增加，膜流動性降低。

1.1.3酶的活性發(fā)生變化

酶在細胞生長代謝過程中發(fā)揮著重要作用，在傳統(tǒng)中國白酒釀造過程中，來自于原料中不同的酶也發(fā)揮著不同的作用，對白酒的風格與品質都有一定的影響，某些酶對合成白酒中重要的香氣成分，酯類物質做出了貢獻[34-35]。而酶的本質是蛋白質，朱敏等人的研究表明，經(jīng)不同體積分數(shù)的乙醇脅迫后，乳酸菌D5-5的乳酸脫氫酶活性明顯低于脅迫之前，酶活性隨著乙醇濃度的升高而降低，即乙醇脅迫對乳酸菌細胞中的酶活性具有抑制作用[36]。

CHEN等人通過測量β-半乳糖苷酶的相對酶活性研究了乙醇對膜滲透性的影響[37]。當細胞遭遇乙醇脅迫后，不同的酶會跟隨乙醇濃度發(fā)生相應的變化，以適應外界環(huán)境的改變。

1.2 乙醇脅迫對乳酸菌代謝的影響

代謝組學可以揭示乙醇脅迫后細菌細胞內代謝物的變化，以闡明外部刺激對某種代謝途徑的影響。有研究表明，乙醇脅迫導致參與檸檬酸代謝和細胞膜結構的基因表達[22]。此外乙醇脅迫還會抑制糖酵解和三羧酸循環(huán)[38]。

CHEN XQ等人通過研究乙醇脅迫對植物乳桿菌細胞內代謝的影響，共檢測出55種主要代謝物，包括19種氨基酸、28種脂肪酸和8種糖；繪制PCA圖可以觀察到乙醇脅迫細胞和對照細胞之間的代謝差異，結果表明不同濃度乙醇下植物乳桿菌細胞內代謝物存在顯著差異；PLS-DA模型與PCA模型聚類結果相似，即在一定的壓力條件下，細胞內代謝物，氨基酸、脂肪酸和碳水化合物，會發(fā)生一定程度的變化; 這與WANG等人的研究結果也相一致[39-40]。

代謝組學分析表明，乙醇脅迫通過抑制三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑，導致代謝通路受到抑制，因此，乙醇對乳酸菌的抑制作用是通過破壞細胞膜功能，從而誘發(fā)細胞內代謝失衡來實現(xiàn)的。通過細胞內代謝物變化的研究，可以了解乙醇對乳酸菌代謝途徑的影響，對于進一步認識乙醇對乳酸菌生長抑制機制具有重要意義。

2 乳酸菌耐受乙醇的機制

2.1 細胞膜調控

細胞膜是微生物抵御外部惡劣環(huán)境的第一道屏障，因此保持健康的膜生理功能有助于乳酸菌的生長和代謝[41]。當乳酸菌在發(fā)酵過程中遭遇乙醇脅迫，對細胞膜的結構和功能產(chǎn)生了干擾，不可避免的對乳酸菌生長代謝造成負面影響；為了應對乙醇脅迫，細胞發(fā)揮了一定策略來應對外部惡劣條件，如膜脂肪酸分布的變化、膜流動性和膜完整性的變化[42]。脂肪酸組成的變化主要表現(xiàn)在飽和程度、鏈長度、分支狀或環(huán)狀脂肪酸等方面，不飽和脂肪酸占比增多，碳鏈長度增加[43]。相關研究也表明，低濃度的乙醇脅迫可以提高共軛亞油酸合成相關酶基因的轉錄水平[44]。

細胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例變動被認為是乳酸菌抵御乙醇脅迫的重要機制，脂肪酸比例的變化會引起細胞膜流動性改變，在一定程度上會影響磷脂雙分子層對外部質子、離子等其他物質的選擇透過性；細胞膜的結構完整性遭到破壞其通透性因此降低，但是乳酸菌會根據(jù)外部環(huán)境及時調整膜結構與組分，使細胞在不利環(huán)境脅迫條件下維持正常生存[45]。

這些結果均表明，調節(jié)膜生理功能，包括膜脂肪酸的分布、流動性和完整性變化，是乳酸菌提高細胞在乙醇脅迫下存活率的重要保護機制之一。

2.2 熱激蛋白的合成

起初熱激蛋白的發(fā)現(xiàn)是在細胞受到高溫條件刺激下的特定蛋白質，發(fā)揮著穩(wěn)定細胞膜和蛋白質的作用，(如圖3所示)也可參與蛋白質的裝配與折疊過程[46]；后來研究發(fā)現(xiàn)在其他物理化學因素的刺激作用下比如說乙醇脅迫，也可以激活熱激蛋白的表達[47]。常見的熱激蛋白主要有分子伴侶蛋白、蛋白酶和DNA重組修復蛋白[48]。當細胞受到乙醇脅迫作用后會引發(fā)細胞內一些酶和功能性蛋白的降解，從而影響細胞的正常生長與新陳代謝，但乳酸菌可發(fā)生應激反應,產(chǎn)生熱激蛋白從而提高細胞對乙醇的抗性。

圖3 熱激蛋白對蛋白質的正確裝配作用

一方面細胞本身會合成熱激蛋白，另一方面細胞在受到乙醇脅迫后也會產(chǎn)生，相關研究表明產(chǎn)生熱激蛋白的乙醇濃度一般為4%，并且隨著乙醇濃度的增加而增加[49]。熱激蛋白中的分子伴侶蛋白，可以防止蛋白質的錯誤折疊與聚集，讓受損肽鏈重新折疊，并將其轉運至線粒體、內質網(wǎng)等細胞器發(fā)揮作用，從而降低乙醇造成的損傷[50]。

而和熱激蛋白有關的基因Hsp31p和Hsp32p基因的表達可發(fā)揮蛋白酶的功能[51]，Hsp150基因可以影響細胞壁及其結構的改變[52]。ADU KT等人的研究表明，當乳酸菌受到環(huán)境脅迫后熱激蛋白上調，在細胞的自我防護作用中發(fā)揮著一定作用[53]。

盡管熱激蛋白在乳酸菌乙醇脅迫過程中提升細胞對乙醇的耐受性發(fā)揮著重要作用，但其誘導和調節(jié)機制尚不明朗仍需進一步探究。

2.3 氨基酸代謝調控

在乳酸菌細胞中氨基酸不僅發(fā)揮著營養(yǎng)物質的功能，還在蛋白質的裝配與折疊過程扮演著重要角色。如表1所示, 不同氨基酸在乳酸菌面臨環(huán)境脅迫后都發(fā)揮著重要作用。乳酸菌受到乙醇脅迫后，氨基酸可以在一定程度上調節(jié)細胞滲透壓從而穩(wěn)定細胞中生物大分子的結構形態(tài)，DNA 的Tm值降低，進而提高乳酸菌對乙醇脅迫的抗性[54]。精氨酸是乳酸菌中的一種氨基酸，可以通過8個酶促步驟從谷氨酸合成，并通過精氨酸脫亞氨酶途徑(ADI途徑)完全降解為鳥氨酸、氨和二氧化碳，此途徑產(chǎn)生一個ATP分子并消耗兩個質子，有助于乳酸菌細胞內部pH穩(wěn)態(tài)，有關報道還表明ADI途徑為細胞存活和對乙醇的耐受提供了能量[55]。此外， SETTACHAIMONGKON S等人分析了乳酸桿菌和雙歧桿菌BB12在乙醇脅迫下的代謝物，結果顯示代謝物變化最大的是氨基酸，這在一定程度上揭示了氨基酸的積累可能是細胞自我保護的重要機制[56]。

表1 環(huán)境脅迫下乳酸菌中氨基酸的生理功能

相關研究表明，乳酸菌中，精氨酸脫亞氨酶(ArcA)，鳥氨酸氨基甲?；D移酶(ArcB)和氨基甲酸酯激酶(ArcC)的精氨酸代謝受到ArgR和AhrC的兩個轉錄調節(jié)因子的調控[57]。這兩個轉錄調節(jié)因子是精氨酸生物合成抑制所必需的，在氨基酸的存在下AhrC是激活精氨酸降解ADI途徑所需的抗阻遏物[58]。DEZ L等人的研究表明在乙醇脅迫乳酸菌中，精氨酸降解的脫亞氨酶途徑的基因(ADI途徑)激活高達42.7倍，參與脂肪酸合成的基因(1.9倍激活)編碼應激蛋白的基因：cspC和cspD(激活高達2.0倍)，然而不管是脂肪酸還是應激蛋白在乳酸菌抵御乙醇脅迫過程中都不同程度的做出了貢獻，所以精氨酸在乳酸菌乙醇脅迫應答中同樣也發(fā)揮著重要作用[59]。DI MARTINO C等人研究了乳酸菌在生長過程中添加外源性脯氨酸時，不同濃度乙醇脅迫情況下其存活率的差異，結果表明脯氨酸提高了乳酸菌的乙醇耐受性[60]。也印證了TAKAGI H等人的研究，脯氨酸可以保護細胞在一定程度上免受損傷，保持細胞膜的完整性，提升對乙醇脅迫的耐受性[61]。

細胞中氨基酸的增加有利于提高細菌對乙醇的耐受性[62]。這與TAKAGI H等人研究基本一致，谷氨酸和蛋白質在細胞中的積累可以保護微生物免受乙醇脅迫[63]。同理，添加外源氨基酸也增加了細菌的乙醇耐受性，這可能是由于氨基酸的加入可以使細胞膜結構更加穩(wěn)定。通過上述細胞內氨基酸代謝的分析，可以得出結論，氨基酸代謝調控是乳酸菌在受到乙醇脅迫后的另一自我調控與保護機制。

2.4 乙醇耐受基因

某些基因的表達對細胞膜的成分合成具有一定貢獻，而完整健康的細胞膜才能抵御乙醇脅迫，所以我們將這些與細胞抵御乙醇脅迫可能有關聯(lián)的基因稱之為乙醇耐受基因。如圖4所示，乳酸菌通過上調某些基因的表達來構筑完整的細胞膜結構，以此提升菌體對乙醇脅迫的耐受性。當乳酸菌面臨乙醇脅迫，與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸相關代謝基因(pyrB、dltA、dltB)在乙醇脅迫后顯著上調表達；而這些氨基酸與細胞壁主要成分肽聚糖、磷壁酸的合成相關，由此可能通過提高這些基因表達構筑完整的細胞膜以此抵御乙醇對細胞的損害[68]。YANG XP等人探討了acrR基因對從中國白酒發(fā)酵谷物中分離出的乳酸菌NF92乙醇的耐受性和適應性機制，通過基因敲除發(fā)現(xiàn)acrR可以積極調節(jié)脂肪酸生物合成，從而提高細胞的乙醇耐受性[69]。

圖4 乳酸菌乙醇脅迫轉錄調控機制

生物信息學分析表明，Oenococcusoeni增強了肽聚糖的生物合成，并且改變了細胞膜脂肪酸組成，增加了recN和mutT基因的表達，從而最大程度地減少了DNA損傷[70]另有研究發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽濃度都有顯著提升，這導致細胞內活性氧(ROS)積累的減少；此外puuE的異源表達表現(xiàn)出膜中兩個ATPase活性的增強，從而保證了細胞膜的完整性；puuE基因通過減少ROS積累和增強細胞膜完整性，發(fā)揮著提高乙醇耐受性的作用[71]。GUO JF等人的研究結果表明pfK和gK對于提升乳酸菌的乙醇耐受性扮演者重要角色，并且可以提高乳酸乳球菌NZ9000的乙醇耐受性；同樣pfK和gK均被認為是具有提高乙醇耐受性的基因[72]。

但是目前人們對于乙醇耐受性基因的相關研究和認識并不多，還需要科研工作者進一步探索。

3 結語

乳酸菌廣泛參與食品的發(fā)酵過程，對食品的組分和風味都有一定的影響，研究乳酸菌在食品中發(fā)揮的作用，特別是在發(fā)酵食品中，乳酸菌面臨乙醇脅迫后的變化及其機制，將有助于加深對乳酸菌特性的認識。

盡管國內外科研人員對乳酸菌乙醇脅迫的機制展開了研究，也取得了部分成果，但對乳酸菌乙醇脅迫后的影響及其變化不夠深入，乳酸菌遭遇乙醇脅迫后，細胞中不飽和脂肪酸增加；熱激蛋白的合成增加了其乙醇耐受性；某些氨基酸，如精氨酸和谷氨酸的積累，提高了細胞對逆境的抗性；同時也發(fā)現(xiàn)了部分乙醇耐受基因。目前研究主要從細胞膜調控、氨基酸代謝調控、熱激蛋白的合成和乙醇耐受基因等其他方面展開研究。

然而在食品發(fā)酵過程中，乳酸菌乙醇脅迫面臨的是一個復雜的環(huán)境，因此如果能夠進一步認識乳酸菌在面臨多種環(huán)境因素脅迫作用下的應答機制，以及在食品發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物變化和對食品發(fā)酵的作用，都具有重要的理論研究價值，將對乳酸菌食品發(fā)酵具有重要指導意義。