分光光度法檢測變性淀粉中羥丙基含量的方法的改良

許志驍

上海工微所科技有限公司,上海 200233

羥丙基淀粉取代度測定或含有羥丙基的變性淀粉中羥丙基含量的方法主要有分光光度法[1]，氣相色譜法[2]和核磁共振波譜法等[3]。其中，分光光度法實驗設(shè)備普及率高，實驗條件簡單，可以成為日常檢測的方法。近年常用的試驗標(biāo)準(zhǔn)為GB 29930[4]、GB 29931[5]、GB 29933[6]以及去年發(fā)布的最新方法GB/T40998—2021[7]。其原理為，淀粉中羥丙基基團在稀硫酸中加熱水解為丙二醇，丙二醇與濃硫酸脫水生成丙醛和丙烯醇，該兩種物質(zhì)在濃硫酸介質(zhì)中與水合茚三酮生成紫色絡(luò)合物，可在特定波長下測試其吸光度。但該方法在實際運用中因細節(jié)不明確、操作差異等原因造成標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差、結(jié)果重復(fù)性低等現(xiàn)象；部分試驗條件要求較高，可操作性差，較易造成誤操作而形成一定的危害。本文主要針對樣品前處理的試驗條件、操作細節(jié)等進行研究并改良，以期提升實驗的可操作性與安全性并獲得穩(wěn)定可靠的實驗結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：變性淀粉樣品1、樣品2、樣品3(羥丙基含量按GB/T40998—2021測定為5.2%、3.0%、1.5%)

試劑：1,2-丙二醇(GC)，硫酸(AR)，亞硫酸氫鈉(AR)，水合茚三酮(AR)

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見光分光光度計Cary 100；微控數(shù)顯加熱板EH45A；電容恒溫水浴鍋HH.S11-2S；玻璃液體溫度計(0 ℃～200 ℃最小分度值2 ℃)；玻璃液體溫度計(0 ℃～100 ℃最小分度值1 ℃)

1.3 試驗方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取1,2-丙二醇0.100 0 g，水定容至100 mL容量瓶中，得1.00 mg/mL儲備液。分別準(zhǔn)確量取儲備液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL儲備液，水定容至100 mL容量瓶中，得10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、40.0 μg/mL、50.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.3.2加熱水解樣品

準(zhǔn)確稱取0.05 g樣品淀粉、空白淀粉于100 mL容量瓶中，加入 25 mL 0.5 mol/L的H2SO4，沸水浴10 min，冷卻至室溫后加水定容。(完全分解的樣液為透明澄清的溶液；空白淀粉為樣品淀粉的同源未變性淀粉)。

1.3.3試樣混合濃硫酸

取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、試樣液于25 mL具塞試管中，置于10 ℃以下水浴，貼壁滴加8 mL硫酸45 s以上，混勻。

1.3.4濃硫酸混合液加熱

混合液混勻后20 ℃水浴1 min，80 ℃～85 ℃水浴10 min，20 ℃水浴1 min。

1.3.5顯色劑的加入

試樣液置于10 ℃±2 ℃水浴20 min，貼壁滴加水合茚三酮溶液，混勻。

1.3.6顯色反應(yīng)

25 ℃水浴60 min，加硫酸至刻度，顛倒混勻，靜置5 min，在30 min內(nèi)，完成所有同批次試樣的吸光度測試。

2 結(jié)果與討論

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液30.0 μg/mL丙二醇溶液：取3.00 mL 1.00 mg/mL儲備液置于100 mL容量瓶中，加入25 mL 0.5 mol/L的 H2SO4。本文以下無特殊說明，試樣液均為30.0 μg/mL丙二醇溶液，以測定平均吸光度最高的試驗條件為最佳條件。為控制變量，本文中除當(dāng)即討論的實驗條件外，其他條件均為GB/T40998—2021中相應(yīng)條件。

2.1 水解加熱時間選擇

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液水解

由實驗原理知丙二醇在濃硫酸中脫水生成丙醛和丙烯醇，而樣品水解介質(zhì)為稀硫酸，如需進行加標(biāo)回收實驗應(yīng)當(dāng)驗證1,2-丙二醇在稀硫酸中加熱水解的情況。試樣沸水浴加熱，分別在0 min、3 min、5 min、10 min、15 min和20 min水平下測定吸光度。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液水解

由圖1可知，丙二醇在稀硫酸介質(zhì)中加熱0 min～15 min時間范圍內(nèi)，穩(wěn)定不分解，在加熱置20 min時吸光度略微下降。

2.1.2樣品淀粉水解

取變性淀粉樣品1、樣品2和樣品3(羥丙基含量5.2%、3.0%、1.5%)及對應(yīng)空白樣品0.05 g置于100 mL容量瓶中，加入25 mL 0.5 mol/L的 H2SO4，沸水浴加熱，分別在0 min、3 min、5 min、10 min、12 min、15 min和20 min水平下測定吸光度。

圖2 樣品淀粉水解

由圖2可知，在3 min時部分樣品的水解不充分，在5 min～12 min時間范圍內(nèi)吸光度穩(wěn)定，最高值在10 min，在15 min時吸光度略微下降。綜合可知，沸水浴10 min為最佳條件。

2.2 加濃硫酸時間及該步驟冰水浴溫度的選擇

硫酸的脫水性與溫度有關(guān)，濃硫酸稀釋放熱會升高介質(zhì)溫度，此步驟應(yīng)確保丙二醇脫水成丙醛和丙烯醇的反應(yīng)不會發(fā)生。因此冰水浴溫度和滴加硫酸時間具體化有助于實際操作。

2.2.1滴加硫酸時間對吸光度影響

取1.00 mL試樣液置于25 mL具塞試管中，在20 ℃水浴中，滴加硫酸(不貼壁)，分別在5 s、10 s、30 s、45 s、60 s和75 s水平下測定吸光度。

圖3 滴加硫酸時間對吸光度影響

由圖3可知，45 s以上時，吸光度不再上升。

2.2.2貼壁加硫酸時間對吸光度影響

取1 mL試樣液置于25 mL具塞試管中，在20 ℃水浴中，貼壁滴加硫酸，分別在5 s、10 s、30 s、45 s、60 s和75 s水平下測定吸光度。

由圖4可知，45 s以上時，吸光度不再上升。貼壁加硫酸方式比加滴硫酸方式的吸光度略高。同時可知，20 ℃下，濃硫酸混合試樣時的放熱，使得一部分丙二醇脫水，在之后加熱中損失。

圖4 貼壁加硫酸時間對吸光度影響

2.2.3加硫酸時冰水浴溫度對吸光度影響

取1 mL試樣液置于25 mL具塞試管中，分別在5 ℃、10 ℃、12 ℃、15 ℃、18 ℃和20 ℃水平下，貼壁滴加硫酸45 s以上，測定吸光度。

圖5 加硫酸時冰水浴溫度對吸光度影響

由圖5可知，冰水浴12 ℃以下時，吸光度平穩(wěn)。

綜合可知最佳條件為10 ℃±2 ℃水浴，貼壁滴加硫酸45 s以上。

2.3 脫水反應(yīng)硫酸濃度的選擇

硫酸的脫水性還與濃度有關(guān)[8]，本試驗選擇用新開封的濃硫酸。

取1 mL試樣液置于25 mL具塞試管中，貼壁滴加硫酸45 s以上，體積分別為6 mL、7 mL、8 mL、9 mL和10 mL水平下，測試吸光度。

由圖6可知，7 mL和8 mL體積時吸光最大且平穩(wěn)，繼續(xù)增大體積，吸光度快速下降。由于吸水性[9]存在，濃硫酸濃度開封后緩慢下降，故選擇高濃度更佳。最佳條件為8 mL。

圖6 脫水反應(yīng)硫酸體積對吸光度影響

2.4 脫水反應(yīng)加熱條件的選擇

根據(jù)GB/T40998—2021脫水反應(yīng)中將內(nèi)含濃硫酸的玻璃試管兩次在冰水浴和沸水浴中切換，容易造成試管爆裂、硫酸噴濺等危險。沸水浴加熱需準(zhǔn)確控制在3 min，實際實驗中，大量試管的準(zhǔn)確加熱、冷卻可操作性不高。在加熱前后設(shè)置緩沖常溫水浴以減少危險性。合理的加熱使硫酸脫水丙二醇的反應(yīng)平穩(wěn)、均勻發(fā)生，提高可操作性。

2.4.1脫水加熱前置常溫水浴對吸光度影響

將冰水浴中的試管，置于20 ℃水浴，分別在0 s、20 s、30 s、45 s、60 s、75 s和90 s水平下沸水浴3 min，測試吸光度。

圖7 脫水加熱前置常溫水浴對吸光度影響

由圖7可知，在60 s水平以下，吸光度平穩(wěn)。

2.4.2脫水加熱后置常溫水浴對吸光度影響

沸水浴3 min后，分別將試管置于20 ℃水浴0 s、10 s、20 s、30 s、45 s和60 s水平下，測試吸光度。

由圖8可知所有的后置常溫水浴時間，都會造成吸光度下降。這是由于冷卻速度不夠，造成丙醛和丙烯醇的進一步脫水分解，造成損失[10]。

圖8 脫水加熱后置常溫水浴對吸光度影響

2.4.3降低脫水水浴溫度及加熱時間對吸光度的影響

嘗試降低脫水加熱的溫度，延長加熱時間，以降低其敏感度，加強實驗的可操作性，降低危險性。將冰水浴中的試管，分別置于40 ℃～45 ℃，50 ℃～55 ℃，60 ℃～65 ℃，70 ℃～75 ℃，80 ℃～85 ℃水浴中，分別加熱3 min、5 min、7 min、9 min、10 min、11 min、13 min、15 min和20 min水平下，測試吸光度。

圖9 降低脫水水浴溫度及加熱時間對吸光度的影響

由圖9可知，80 ℃～85 ℃水浴9 min～15 min吸光度平穩(wěn)。加熱時間較GB/T40998—2021更寬泛，有效提升實際可操作性。

2.4.4在80 ℃～85 ℃水浴后置常溫水浴對吸光度影響

硫酸混合溶液經(jīng)80 ℃～85 ℃水浴10 min后，分別置于20 ℃水浴30 s、60 s、75 s、90 s水平下，測試吸光度。

由圖10可知，在80 ℃～85 ℃水浴后，常溫水浴60 s左右，不影響吸光度。

綜合可知最佳條件為：20℃水浴60 s，80 ℃～85 ℃水浴10 min，20 ℃水浴60 s后置于冰水浴中。

圖10 在80 ℃～85 ℃水浴后置常溫水浴對吸光度影響

2.5 添加顯色溶液時，冰水浴的溫度與時間的選擇

溫度過高的濃硫酸介質(zhì)溫度除了會進一步脫水丙醛和丙烯醇外，還會分解水合茚三酮[10]，都會造成絡(luò)合物的減少。應(yīng)當(dāng)具體化冷卻試樣的的溫度，但實際實驗中直接測量試樣溫度會損失溶液量，因此應(yīng)當(dāng)具體化冷卻時間。

2.5.1加顯色溶液時混合溶液溫度對吸光度影響

將加熱后的試管置于5 ℃水浴中，將溫度計置于試管中測量硫酸混合液的溫度30 s后讀數(shù)后貼壁加水合茚三酮溶液，分別在混合液溫度30 ℃、20 ℃、15 ℃和10 ℃水平下測試吸光度。

圖11 加顯色溶液時混合溶液溫度對吸光度影響

由圖11可知，在混合液溫度15 ℃及以下時，吸光度平穩(wěn)。

2.5.2混合液冷卻至15 ℃的時間選擇

將加熱后的試管置于10 ℃±2 ℃水浴中，分別水浴5 min、10 min、15 min、20 min和25 min水平下，用溫度計置于試管中30 s，測量混合液溫度。

由圖12可知，10 ℃±2 ℃水浴20 min以上可將混合液溫度降至15 ℃以下。可知10 ℃±2 ℃水浴20 min貼壁滴加水合茚三酮溶液為最佳條件。

圖12 混合液冷卻至15 ℃的時間選擇

2.6 顯色水浴時間的選擇

不同文獻對反應(yīng)時間的選擇不同，按GB/T40998—2021中顯色定容后，應(yīng)準(zhǔn)確靜置5 min后測定吸光度。實際實驗中大量試管準(zhǔn)確地在100 min+5 min條件下完成測定的可操作性不高。應(yīng)當(dāng)探究合理的反應(yīng)時間與測定時間段。

將加入顯色溶液后的混合液分別在25 ℃水浴40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min、110 min和120 min水平下測試吸光度。

圖13 顯色水浴時間對吸光度影響

由圖13可知，吸光度在70 min時達到最大，60 min～110 min時間內(nèi)，吸光度保持平穩(wěn)，120 min后吸光度下降較快。

水浴時間應(yīng)優(yōu)化為：25 ℃水浴60 min，加硫酸至刻度，顛倒混勻，靜置5 min以上，在40 min內(nèi)完成同批次所有試樣的吸光度檢測。

2.7 選擇以上最優(yōu)條件下的改良試驗

2.7.1丙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中為丙二醇濃度μg/mL；f為稀釋后體積mL，本方法中為100 mL；0.776 3為丙二醇轉(zhuǎn)化羥丙基系數(shù)。制作丙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖14 丙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖14可知，在丙二醇濃度在10.0 μg/mL～50.0 μg/mL范圍內(nèi)，線性較好，曲線方程為y=0.010 5x-0.001 1(R2=0.999 8)。

2.7.2重復(fù)性與回收率

表1 重現(xiàn)性測試

由表1可知，RSD為1.88%、2.30%和2.86%，精密度較高。

在取樣變性淀粉樣品1、樣品2和樣品3(羥丙基含量按GB/T40998—2021測定為5.2%、3.0%、1.5%)0.05 g上加標(biāo)1.00 mL 1.00 mg/mL 1,2-丙二醇儲備液。

由表2可知，對于落在曲線不同位置的數(shù)據(jù)回收率良好，符合實驗要求。

3 結(jié)論與分析

本文改良的分光光度計測定變性淀粉中羥丙基含量得試驗方法。在80 ℃～85 ℃水浴脫水反應(yīng)10min，相比原方法準(zhǔn)確沸水浴3 min拉長了操作時間，降低了水浴溫度，可以在大量樣品的實驗中，顯著提高可操作性。在脫水反應(yīng)前后進行常溫水浴1 min，相比原方法中立即切換冰/沸水浴，可以有效防止試管爆裂，提高安全性。在線性范圍內(nèi)數(shù)據(jù)的回收率與精密度均良好，符合實驗要求，可用于日常的檢測中。

表2 回收率測試

硫酸的吸水性使得開封的硫酸濃度隨時間推移而下降。在現(xiàn)有的加熱條件下，實驗結(jié)果對硫酸濃度敏感性大，因此實驗脫水用硫酸應(yīng)確保密封，實驗樣品不宜過多，以防前后樣品硫酸濃度差異而影響實驗結(jié)果。