冠狀動脈擴張患者淋巴細胞和單核細胞亞型分析

劉銳鋒， 盛倩倩， 張 悅， 趙慧強

（首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050）

冠狀動脈（冠脈）擴張（coronary artery ectasia,CAE）定義為冠脈直徑超過正?；蛘呦噜弰用}段直徑的1.5倍以上[1]。大多數(shù)CAE病例是通過冠脈造影等影像學檢查診斷。接受冠脈造影評估的患者有1.2%～7.4%被診斷為CAE[2]。超過90%的CAE患者合并有冠心?。╟oronary heart disease，CHD），表現(xiàn)為冠脈粥樣硬化改變，包括斑塊負荷、脂質(zhì)沉積和冠脈中層膽固醇結(jié)晶[1,3]。CAE的病因和發(fā)病機制尚不清楚，目前認為CAE是一種炎癥性疾病，因為CAE患者表現(xiàn)為外周血細胞炎癥因子失衡和冠脈壁大量炎癥細胞浸潤[3-5]。此外CAE患者冠脈中間層的平滑肌和彈性纖維層有明顯的破壞，這種改變與免疫系統(tǒng)紊亂相關血管炎的病理變化相似[1]。因此，了解CAE是否伴隨免疫系統(tǒng)紊亂很重要，關系到CAE患者的病因探討和是否可能應用免疫相關治療。因此，本研究擬通過檢測CAE患者的外周淋巴細胞和單核細胞亞型來初步回答，CAE是否同時存在炎癥和免疫系統(tǒng)異常。外周血淋巴細胞分為以下亞型：T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD19+）和自然殺傷（natural killer，NK）淋巴細胞（CD3-CD16+和CD56+或CD56+）；T細胞進一步分為輔助性T細胞2群（CD3+CD4+）和輔助性T細胞1群（CD3+CD8+）[6]。根據(jù)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）共受體（CD14）和FcγRⅢ受體（CD16）的表達，單核細胞被分為經(jīng)典型（CD14++CD16-）、中間型（CD14++CD16+）和非經(jīng)典型（CD14+CD16++）3種亞型[7]。本研究通過流式細胞儀來進行檢測和分類。

對象和方法

一、研究對象

2017年1月至2018年1月，共有2 506例患者在北京友誼醫(yī)院心導管中心接受冠脈造影檢查，56例（2.23%）確診患有CAE。連續(xù)12個月，按照每例CAE患者接受冠脈造影和確診的日期，采用抽簽法隨機選擇在同一日期內(nèi)接受冠脈造影的CHD患者和冠脈相對正常的受試者（對照），保持年齡、性別、高血壓、吸煙史、血脂、飲酒、肝功能、腎功能等基線資料基本平衡。本研究根據(jù)納入和排除標準初步納入其中34例CAE患者，同日期與之匹配的有30例CHD患者和32例對照人群。冠脈造影結(jié)束后，立即采集外周血液并進行流式細胞檢測。該研究經(jīng)北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》進行，已獲得了所有參與者的知情同意。對CAE、CHD和對照組之間的基線數(shù)據(jù)、關鍵的實驗室檢測和冠脈造影特征進行全面的比較和分析。

1.納入標準：CAE被定義為冠脈直徑超過相鄰的正常冠脈段的1.5倍[1]。根據(jù)目前的共識，CHD被定義為1個或多個主要冠脈存在≥50%狹窄，將狹窄≤20%且無其他冠脈異常的受試者作為對照[8]。

2.排除標準：懷孕或患有急性冠脈綜合征、心肌病、心肌炎、瓣膜心臟病、心力衰竭、其他血管動脈瘤、此前確診為膠原組織疾病和血管炎疾病、梅毒、明確診斷的肺栓塞和主動脈夾層、嚴重的肝功能或腎功能障礙、凝血功能障礙、活動性出血、惡性腫瘤、傳染病、既往感染史（＜3個月）及其他炎癥性疾病或治療遵從性較差者。

二、方法

1.基本的臨床特征：研究對象的醫(yī)療記錄和冠脈造影數(shù)據(jù)資料完整而詳細。大多數(shù)數(shù)據(jù)來自病歷和導管室數(shù)據(jù)庫，包括人口學數(shù)據(jù)（如年齡和性別）、既往病史（如高血壓和糖尿病）、家族史和個人史（如吸煙、飲酒）。體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）=體重/身高的平方（kg/m2）。

2.生化指標：患者入院后次日上午行靜脈采血。北京友誼醫(yī)院臨床實驗室對所有受試者的血樣進行分析，包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油 （triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、白細胞計數(shù)、單核和淋巴細胞計數(shù)、高敏C反 應 蛋 白 （high-sensitivity C-reaction protein,hs-CRP）、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、總膽紅素和間接膽紅素（據(jù)報道可以作為抗氧化因子參與炎癥反應過程[9-10]）。

3.淋巴細胞和單核細胞亞型的流式細胞學分析：以下抗人單克隆抗體（monoclonal antibody，MoAb）（購自美國加州圣地亞哥BioLegend公司）用于流式細胞學分析。PE抗人CD3抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）抗人CD4抗體、PerCP抗人CD8α抗體、PerCPCy55抗 人CD16抗體、抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）抗人CD19抗體和FITC抗人CD14抗體。冠脈造影后立即用肝素鈉抗凝血劑采集外周血，并在采集后1 h內(nèi)進行流式細胞分析：將100 μL的全血樣本與用上述抗體在室溫中染色30 min。加入2 mL 1×熒光激活細胞分選儀（fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）溶解液（BD生物科學公司），將混合物輕輕旋轉(zhuǎn)，然后在黑暗中孵化10 min，使紅細胞溶解。將白細胞離心分離，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌，然后懸浮在500 μL PBS中進行流式細胞術。用FACS Jazz細胞計對樣本進行分析（BD生物科學），使用FACS軟件（BD生物科學）操作。淋巴細胞和單核細胞亞群根據(jù)向前和側(cè)散射特性進行門控，使用FlowJo軟件（美國）對流式細胞術數(shù)據(jù)進行分析[7,11]。

4.冠脈成像特征：通過穿刺橈動脈或者股動脈行冠脈造影，不使用腺苷或鈣通道阻滯劑。冠脈主要分為：左主干、左前降冠脈、左回旋支，右冠脈。冠脈血流情況[心肌梗死溶栓治療（thrombolysis in myocardial infarction，TIMI）幀數(shù)計數(shù)（TIMI frame count,TFC）][12]，狹窄程度（Genisi評分確定）[13]，以及擴張程度，由2位經(jīng)驗豐富的心臟專家閱片確定。

三、統(tǒng)計學分析

通過SPSS 25.0版進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)最初都通過科爾莫戈羅夫-斯米爾諾夫測試進行分析，以評估其正態(tài)性。連續(xù)數(shù)據(jù)顯示為正態(tài)分布時的x±s，以及非高斯分布時的中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（Q1,Q3）]，通過單因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis法分析連續(xù)性數(shù)據(jù)。最小顯著性差異法或Nemenyi檢驗用于2組之間的多次比較。非參數(shù)數(shù)據(jù)按百分比（%）進行評估，并使用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗對各組進行比較。通過后退法對非經(jīng)典單核細胞進行多元線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況

3組研究對象在年齡、性別、高血壓發(fā)病率、血壓、血脂、肝功能、腎功能等基線數(shù)據(jù)方面差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。CAE組和CHD組患糖尿病的比例大于對照組（P＜0.05），但3組之間糖化血紅蛋白差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 研究對象的基線特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

表1 研究對象的基線特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

CHD：冠心病（coronary heart disease）；CAE：冠脈擴張（coronary artery ectasia）；TC：總膽固醇（total cholesterol）；TG：三酰甘油（triglycerides）；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol）；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol）；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase）；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase）。

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二、患者炎癥指標和冠脈造影特征

3組患者白細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞淋巴細胞（neutrophil lymphocyte，NL）比值、ESR、hs-CRP、總膽紅素或直接總膽紅素等差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。CAE患者和CHD患者的冠脈狹窄范圍（冠脈各分支受累概率）和狹窄程度（Gensini積分）差異無統(tǒng)計學意義。CAE患者冠脈各分支的血流慢于CHD患者[LAD 39.50（33.00,48.25）比28.00（22.00,39.00），LCX 37.50（28.75,52.25）比25.00（19.00,37.00），RCA 30.00（24.00,44.00）比21.00（18.00,31.00）]。CAE患者中，右冠脈擴張受累的比例最高（76.5%）；Markis分型Ⅰ型9例（26.5%）、Ⅱ型3例（8.8%）、Ⅲ型15例（44.1%）和Ⅳ型7例（20.6%）（見表2）。

表2 3組患者炎癥指標和冠脈造影特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

表2 3組患者炎癥指標和冠脈造影特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

CHD：冠心?。╟oronary heart disease）；CAE：冠脈擴張（coronary artery ectasia）；NL比值：中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio）；hs-CRP：超敏C反應蛋白（high sensitivity C-reactive protein）；ESR：紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate）；TFC：心肌梗死溶栓治療冠脈血流幀數(shù)計數(shù)[thrombolysis in myocardial infarction（TIMI）frame count]。

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三、淋巴細胞亞群和單核細胞亞群分析

CAE組和CHD組之間的淋巴細胞亞型差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。然而，與CHD和對照組相比，CAE組的非經(jīng)典單核細胞比例顯著增加、經(jīng)典型單核細胞比例顯著下降（均P＜0.05）（見表3、圖1）。

圖1 外周血單核細胞亞群分析

表3 淋巴細胞亞群和單核細胞亞群分析[M（Q1，Q3），%]

四、多元線性回歸分析

非經(jīng)典單核細胞的百分比值被設定為因變量，自變量包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙史、飲酒、BMI、hs-CRP、ESR、TC、TG、HDL-C、LDL-C、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)、NL比值、總膽紅素、直接膽紅素、ALT、AST、尿素氮、肌酐和Gensini評分。設定CAE、CHD和對照組分別為1、2和3，多元重線性回歸分析結(jié)果見表4：非經(jīng)典單核細胞的百分比值與組別和高血壓負相關，和炎癥指標（中性粒細胞、ESR）正相關。

表4 以非經(jīng)典型單核細胞為因變量進行多重線性回歸

討 論

CAE是一種少見疾病，其病因尚不清楚。超過90%的CAE患者并發(fā)CHD，而其他患者則并發(fā)系統(tǒng)性血管炎（包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和白塞?。⒏腥荆ㄈ绱ㄆ椴『头窝滓略w感染）和遺傳性疾病[2,14-15]。目前認為大多數(shù)冠脈出現(xiàn)動脈粥樣硬化的CAE是一種炎癥性疾病，但是其典型的病理變化是冠脈中層的破壞甚至缺如，其表現(xiàn)類似于免疫異常參與血管炎的病理改變。因此，確定這些CAE患者是否合并免疫異常，對CAE的病因探討和治療有重要的臨床意義。本研究將CHD患者和冠脈相對正常的受試者作為對照，采集各組患者的新鮮外周血樣，提取其中的白細胞，然后用多種熒光抗體標記白細胞表面的抗原成分，通過流式細胞術探測熒光抗體的信號差異，從而間接分析外周血淋巴細胞和單核細胞的比例和亞型分布。

本研究數(shù)據(jù)顯示，3組研究對象的基線數(shù)據(jù)具有可比性。CAE患者和CHD患者的冠脈狹窄范圍（冠脈各分支受累概率）和狹窄程度（Gensini積分）無明顯差異，提示在冠脈粥樣硬化病變程度上2組無明顯差異。關于炎癥指標，如白細胞計數(shù)、ESR、hs-CRP等，CAE和CHD組差異均無統(tǒng)計學意義，提示2組之間炎癥水平相當或因為樣本量的原因未能顯示出差異。關于淋巴細胞亞群的分布，CAE組與CHD組無明顯差異，提示CAE組可能并不涉及額外的免疫反應過程。關于單核細胞亞群，與CHD和對照組相比，CAE組的非經(jīng)典單核細胞水平顯著升高，經(jīng)典單核細胞水平顯著降低，隨后的多重線性回歸分析進一步證實了高非經(jīng)典型單核細胞比例與CAE相關，提示CAE患者處于一種炎癥狀態(tài)。

非經(jīng)典單核細胞表達高水平的促炎因子，如腫瘤壞死因子和白介素1-β，具有促進炎癥反應作用。經(jīng)典型單核細胞修復組織和調(diào)節(jié)免疫功能，中間型單核細胞參與抗原的呈遞和血管生成。在炎癥條件下，經(jīng)典型單核細胞可發(fā)育為中間型和非經(jīng)典型單核細胞[7,11]。因此本研究中單核細胞表型的變化提示CAE存在炎癥反應狀態(tài)。以往研究提示CAE為一種炎癥性疾病：在CAE的冠脈血管壁中浸潤了大量炎癥細胞，包括中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞[16]，同時CAE患者的外周血數(shù)種炎癥細胞因子增加等[17-19]。因此總體上，CAE是一種炎癥性疾病，與CHD相比，單核細胞可能更多地參與CAE的病理過程。

CAE典型的病理學特征是嚴重的血管中層損傷，甚至完全沒有血管中層，蛋白酶降解可能在CAE患者細胞外基質(zhì)的異常代謝過程中發(fā)揮重要作用[20-23]。炎癥、免疫紊亂、感染、遺傳變異或其他機制可能會影響血管中層的損傷。本研究表明，與CHD組比較，免疫系統(tǒng)紊亂可能并沒有參與CAE的病理過程，因為CAE患者的淋巴細胞亞型與CHD患者沒有顯著差異；同時其他研究也沒有發(fā)現(xiàn)CAE患者抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）和抗中性粒細胞細胞質(zhì)抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）（包括抗蛋白酶3ANCA和抗骨髓過氧化物酶ANCA）等與對照人群的差異[24]。因此，本研究推斷，CAE潛在發(fā)病機制更多的可能是炎癥過程，而不是免疫異常。未來需要更多研究來闡明CAE患者的炎癥狀態(tài)和病理變化的關系。

總結(jié)本研究，大多數(shù)于冠脈造影中發(fā)現(xiàn)的伴隨CHD的CAE患者更可能是一種炎癥性疾病，而不是一種免疫性疾病。本研究存在一些不足和局限性，為單中心研究、樣本量有限、未提供參與者的后續(xù)隨訪數(shù)據(jù)。進一步的研究應包括更大的樣本量和詳細的隨訪，以獲得更多有用的臨床信息。