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    腹腔注射右美托咪定后小鼠大腦響應(yīng)區(qū)域初探

    2022-11-01 11:25:24許德嬌岑華蕊王烈成
    關(guān)鍵詞:腦區(qū)神經(jīng)元代表

    李 昊,許德嬌,岑華蕊,程 娟,王烈成

    右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)作為一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑,它可產(chǎn)生與正常睡眠相似、可喚醒的效果,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和應(yīng)激保護(hù)作用[1]。Dex可使機(jī)體體溫和血壓在安全范圍內(nèi)有一定的下降;Dex通過(guò)激活藍(lán)斑(locus coeruleus,LC)的下行抑制系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,由脊髓α2受體介導(dǎo)[2];具有神經(jīng)保護(hù)作用[3],在抵抗應(yīng)激、炎癥和腦損傷中具有器官保護(hù)作用[4]。目前該藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床。催產(chǎn)素(oxytocin,OXT)是一種神經(jīng)肽,具有多種功能,包括收縮子宮,尤其以妊娠子宮更加敏感;在哺乳期可以促進(jìn)分泌乳汁;具有神經(jīng)保護(hù)作用,在抗焦慮、降低炎癥反應(yīng)、學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮作用[5]。Dex是否可以作用在OXT神經(jīng)元,尚未見(jiàn)報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)研究Dex對(duì)丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus,PVN)、丘腦室上核(supraoptic nucleus,SON)腦區(qū)的c-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記情況,進(jìn)一步探究Dex是否會(huì)增強(qiáng)OXT釋放進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SPF小鼠(C57BL/6J),年齡8~10周(體質(zhì)量21~26 g),采購(gòu)于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)飼料和無(wú)菌水,在室溫(26±1) ℃,濕度40%~70%,光/暗循環(huán)12 h/12 h(從08:00—20:00開(kāi)燈)。符合安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求(倫理號(hào):20190235),并在實(shí)驗(yàn)中努力減少小鼠的數(shù)量及減輕它們所經(jīng)歷的任何疼痛或者不適。

    1.1.2藥品與試劑 右旋美托咪定注射液購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;兔源一抗c-Fos抗體、鼠源一抗c-Fos抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔源一抗AVP抗體、兔源一抗OXT抗體購(gòu)自美國(guó)ImmunoSta公司;羊抗兔和羊抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Alexa Fluor分子探針公司;山羊血清封閉液、Fluoromount水性封片劑購(gòu)自德國(guó)Sigma-aldrich公司。曲拉通X-100 購(gòu)自上海昂一生物公司。

    1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 灌流蠕動(dòng)泵(河北齊力恒流泵有限公司);冷凍切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司);小鼠腦槽儀(深圳瑞沃德公司);熒光倒置顯微鏡、玻片掃描儀(日本奧林巴斯公司);共聚焦顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)。

    1.2 方法

    1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方式 取8~10周C57小鼠18只,隨機(jī)分為Saline組和Dex組,給藥方式為腹腔注射(ip),每只小鼠注射劑量為:0.1 ml/10 g。其中,Saline組給予生理鹽水,Dex組給予Dex(100 μg/kg)。

    1.2.2小鼠完整大腦取材 小鼠在下午15:00給藥前使用0.04 %異氟烷吸入麻醉后,迅速進(jìn)行腹腔注射。然后將小鼠在籠中放置120 min后,使用戊巴比妥鈉(80 mg/kg)將小鼠麻醉,再依次用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%多聚甲醛(PFA)通過(guò)心臟灌流對(duì)大腦固定,剝離顱骨取腦后放入蔗糖溶液脫水3 d。

    1.2.3小鼠大腦全腦冰凍切片 首先將脫水完整的大腦放在腦槽儀下沿冠狀面均切成兩部分,切后光滑面作為底座,使用OCT包埋劑包埋后放在冰凍切片機(jī)的冰座臺(tái)上。冷凍完成后進(jìn)行全腦厚度40 μm一層的切片,按順序放入含有0.01 mol/L PBS溶液的24孔板中。

    1.2.4免疫熒光

    1.2.4.1c-Fos免疫熒光染色 取出腦片放入孔板中,用PBS漂洗腦片3次(每次10 min),5%山羊血清在PBST(0.05% Triton X-100)放入37 ℃水浴鍋封閉1 h,加入相應(yīng)兔來(lái)源的c-Fos單一抗體(1 ∶4 000)于4 ℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗3次,加入相應(yīng)兔源綠色熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS漂洗3次,細(xì)胞核用DAPI(1 ∶2 000)孵育20 min。PBS漂洗1次。

    1.2.4.2c-Fos和OXT神經(jīng)元免疫熒光共染色 挑選、漂洗、封閉腦片同1.2.4.1加入鼠來(lái)源的c-Fos單一抗體(1 ∶1 000)和兔來(lái)源的OXT神經(jīng)元抗體(1 ∶2 000),于4 ℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗3次,加入相應(yīng)兔源紅色熒光和鼠源綠色熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS漂洗3次。

    1.2.5免疫熒光成像后陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 本課題中免疫熒光分為兩部分。第一部分大腦腦區(qū)的c-Fos細(xì)胞表達(dá)是利用奧林巴斯玻片掃描儀顯微成像。第二部分特定腦區(qū)的c-Fos細(xì)胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記是利用蔡司共聚焦顯微成像。對(duì)于玻片掃描儀顯微成像后的腦片利用Image J軟件通道拆分和劃定的腦區(qū)自動(dòng)計(jì)數(shù),為保證計(jì)數(shù)精確,再人工對(duì)每個(gè)自動(dòng)計(jì)數(shù)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)于蔡司共聚焦顯微成像的腦片,使用蔡司成像軟件來(lái)觀測(cè)各層細(xì)胞數(shù)量。切片厚度40 μm,采用10 μm一層進(jìn)行層掃,每張腦片成像約有4~6幅。根據(jù)細(xì)胞前后成像的變化,判斷c-Fos細(xì)胞和OXT神經(jīng)元是否在同一層,若是,則可判斷為共標(biāo)記細(xì)胞。

    2 結(jié)果

    2.1 Dex對(duì)睡眠腦區(qū)腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral preoptic nucleus, VLPO)和運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的c-Fos細(xì)胞影響免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與Saline組相比,Dex組M1/M2區(qū)域的c-Fos細(xì)胞表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.64,P<0.001)(圖1 A、B、E);與Saline組相比,Dex組促睡眠腦區(qū)VLPO中c-Fos細(xì)胞表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.15,P<0.05)(圖1 C、D、F)。

    圖1 運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)M1/M2和促睡眠腦區(qū)VLPO的免疫熒光代表圖(n=5)A:Saline組M1/M2腦區(qū)免疫熒光代表圖;B:Dex組M1/M2腦區(qū)免疫熒光代表圖;C:Saline組VLPO腦區(qū)免疫熒光代表圖;D:Dex組VLPO腦區(qū)免疫熒光代表圖;E:M1/M2腦區(qū)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖;F:VLPO腦區(qū)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖;1:×10;2:×20;3:×5;與Saline組比較:*P<0.05,***P<0.001

    2.2 Dex對(duì)促覺(jué)醒相關(guān)腦區(qū)的c-Fos細(xì)胞表達(dá)的影響免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與Saline組相比,Dex組LC腦區(qū)中c-Fos的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.45,P<0.01)(圖2 A、B、K);與Saline組相比,Dex組外側(cè)下丘腦(lateral hypothalamic area, LH)中c-Fos細(xì)胞表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.40,P<0.001)(圖2 C、D、L);與Saline組相比,Dex組腹側(cè)結(jié)節(jié)乳頭體核(ventral tuberomammillary nucleus, TMN)腦區(qū)c-Fos細(xì)胞表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.00,P<0.01)(圖2 E、F、M);與Saline組相比,Dex組背外側(cè)背蓋核(laterodorsal tegmental nucleus, LDT),臂旁核(parabigeminal nucleus, PB)兩個(gè)腦區(qū)c-Fos細(xì)胞表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tPB=9.17,tLDT=6.44,P<0.01)(圖2 G~J、N、O)。

    圖2 促覺(jué)醒相關(guān)腦區(qū)的免疫熒光c-Fos代表圖(n=5)A:Saline組LC腦區(qū)免疫熒光代表圖;B:Dex組LC腦區(qū)免疫熒光代表圖;1:×10;2:×20;C:Saline組LH腦區(qū)免疫熒光代表圖;D:Dex組LH腦區(qū)免疫熒光代表圖;1:×5;2:×10;E:Saline組TMN腦區(qū)免疫熒光代表圖;F:Dex組TMN腦區(qū)免疫熒光代表圖;1:×5;2:×10;G:Saline組LDT腦區(qū)免疫熒光代表圖;H:Dex組LDT腦區(qū)免疫熒光代表圖;1:×5;2:×20;I:Saline組PB腦區(qū)免疫熒光代表圖;J:Dex組PB腦區(qū)免疫熒光代表圖;1:×5;2:×10;K~O:LC、LH、TMN、LDT、PB腦區(qū)c-Fos細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖;與Saline組比較:**P<0.01,***P<0.001

    2.3 Dex對(duì)大腦感覺(jué)神經(jīng)核SFO、AP、SOL的c-Fos細(xì)胞表達(dá)影響免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與Saline組相比,Dex組的小鼠穹窿下器(subfornical organ, SFO)腦區(qū)c-Fos細(xì)胞表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.22,P<0.01)(圖3 A、B、E);與Saline組相比,Dex組延髓最后區(qū)(area postrema, AP)和孤束核(solitary tract, SOL)腦區(qū)的c-Fos細(xì)胞表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tAP=-12.15,tSOL=-7.05,P<0.001)(圖3 C、D、F、G)。

    圖3 Dex對(duì)機(jī)體感覺(jué)神經(jīng)核SFO、AP、SOL的影響(n=5)A:Saline組SFO腦區(qū)免疫熒光代表圖;B:Dex組SFO腦區(qū)免疫熒光代表圖;1:×5;2:×10;C:Saline組AP、SOL腦區(qū)免疫熒光代表圖;D:Dex組AP、SOL腦區(qū)免疫熒光代表圖;0:AP、SOL腦區(qū) ×5;1:AP腦區(qū) ×20;2:SOL腦區(qū) ×10;E~G:SFO、AP、SOL腦區(qū)c-Fos細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖;與Saline組比較:**P<0.01,***P<0.001

    2.4 Dex對(duì)PVN、SON、SCN腦區(qū)的c-Fos細(xì)胞表達(dá)的影響免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與Saline組相比,Dex組SON腦區(qū)c-Fos細(xì)胞表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.73,P<0.05)(圖4 A、B、G);Dex組PVN和視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)腦區(qū)c-Fos細(xì)胞表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4 C~F、H、I)。

    圖4 SON、PVN、SCN腦區(qū)免疫熒光c-Fos表達(dá)代表圖(n=5)A:Saline組SON腦區(qū)免疫熒光代表圖;B:Dex組SON腦區(qū)免疫熒光代表圖;1:×10;2:×20;C:Saline組PVN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10;D:Dex組PVN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10;E:Saline組SCN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10;F:Dex組SCN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10;G~I(xiàn):SON、PVN、SCN腦區(qū)c-Fos細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖;與Saline組比較:*P<0.05

    2.5 Dex對(duì)PVN、SON中OXT神經(jīng)元和c-Fos細(xì)胞共標(biāo)記的影響本實(shí)驗(yàn)中,小鼠腹腔注射給藥后進(jìn)行免疫熒光c-Fos細(xì)胞和OXT神經(jīng)元共成像。顯微成像后,統(tǒng)計(jì)了共標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量占總的OXT神經(jīng)元和總的c-Fos細(xì)胞的比例。本研究選擇年齡相仿的小鼠,OXT神經(jīng)元在個(gè)體間差別不大,圖5 F餅圖顯示的是Dex組和Saline組對(duì)應(yīng)的腦區(qū)總OXT神經(jīng)元數(shù)量是基本一致。染色和統(tǒng)計(jì)質(zhì)量無(wú)誤后,進(jìn)行共標(biāo)記統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示,與Saline組相比,Dex組PVN、SON腦區(qū)共標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)占總OXT神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A~E)。

    統(tǒng)計(jì)共標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)占該腦區(qū)總的c-Fos細(xì)胞的比例,結(jié)果顯示:與Saline組相比,Dex組在PVN腦區(qū)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Dex組在SON腦區(qū)比例下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.73,P<0.05)(圖5 G)。

    圖5 Saline組及Dex組PVN、SON腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖(n=4) ×20A:Saline組PVN腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖;B:Dex組PVN腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖;C:Saline組SON腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖;D:Dex組SON腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖;E:c-Fos細(xì)胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記數(shù)與OXT神經(jīng)元的比例;F:PVN、SON腦區(qū)總OXT神經(jīng)元數(shù)量及共標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)占總OXT神經(jīng)元比例;G:c-Fos細(xì)胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)數(shù)與c-Fos細(xì)胞數(shù)量的比例;1:紅色熒光標(biāo)記的OXT神經(jīng)元;2:綠色熒光標(biāo)記的c-FOS細(xì)胞;3:共標(biāo)記圖;箭頭:指示共標(biāo)記的細(xì)胞的位置;與Saline組比較:*P<0.05

    3 討論

    結(jié)果顯示:Dex對(duì)促睡眠相關(guān)腦區(qū)細(xì)胞表達(dá)顯著激活,如VLPO腦區(qū);而對(duì)促覺(jué)醒與運(yùn)動(dòng)等相關(guān)腦區(qū)細(xì)胞表達(dá)顯著抑制,如LC、LH、TMN、LDT、PB、M1/M2等腦區(qū)。

    作為一種麻醉劑,Dex不可避免地會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能下降,本課題中,運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)M1/M2的c-Fos細(xì)胞表達(dá)顯著降低。VLPO是位于下丘腦外側(cè)與睡眠密切相關(guān)的促睡眠腦區(qū),在整個(gè)睡眠過(guò)程中,VLPO表現(xiàn)非?;钴S,c-Fos細(xì)胞表達(dá)顯著增高[6]。LC是經(jīng)典的促覺(jué)醒的核團(tuán),其內(nèi)含有豐富的去甲腎上腺素合成神經(jīng)元,這些神經(jīng)元在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)出彌散投射,LC-去甲腎上腺素系統(tǒng)在喚醒、應(yīng)激反應(yīng)中起主要作用[7]。LH是前腦的重要組成部分,是覺(jué)醒、防御和新陳代謝的重要控制器,包括食欲素神經(jīng)元、黑色素濃縮激素神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,食欲素神經(jīng)元被鑒定為促覺(jué)醒神經(jīng)元[8],免疫熒光顯示Dex可以顯著抑制其活性。LDT在引發(fā)和維持REM睡眠中起重要作用[9],其主要含有膽堿能和非膽堿能神經(jīng)元。免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí),LDT在快速眼動(dòng)睡眠剝奪后的反彈期間膽堿能和非膽堿能神經(jīng)元與Fos細(xì)胞共標(biāo)記數(shù)量顯著增多[9]。本課題免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,Dex降低LDT區(qū)域c-Fos細(xì)胞的數(shù)量,這與Dex減少REM睡眠的結(jié)果相一致。有文獻(xiàn)表明,Dex可以在整個(gè)睡眠周期中會(huì)提高非快速眼動(dòng)睡眠的比例[10]。此外,LDT中一半以上的膽堿能神經(jīng)元表達(dá)有α2受體,提示Dex可能通過(guò)LDT的α2受體抑制神經(jīng)元活性,從而減少REM睡眠。然而,Dex是否直接抑制LDT神經(jīng)元,需要電生理膜片鉗技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。PB位于腦橋灰質(zhì)的重要促覺(jué)醒核團(tuán)之一,免疫熒光結(jié)果顯示,Dex可減少PB的c-Fos細(xì)胞表達(dá),提示Dex誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜催眠作用可通過(guò)抑制PB神經(jīng)元興奮來(lái)介導(dǎo)。SOL是延髓背側(cè)的一個(gè)主要感覺(jué)核,接收心血管、內(nèi)臟、呼吸、味覺(jué)和觸覺(jué)的信息[11]。SFO位于第三腦室,在心血管調(diào)節(jié),能量平衡,免疫反應(yīng)和水礦物質(zhì)平衡方面發(fā)揮作用。SFO缺乏血腦屏障,可以直接感受腦脊液中水礦物質(zhì)的變化,尤其對(duì)Na+水平更加敏感,控制水和鹽的攝入[12]。如果被激活可能代表機(jī)體水鹽失衡,會(huì)主動(dòng)尋求飲水。Dex的使用可以降低血壓,當(dāng)機(jī)體血壓下降時(shí),血管緊張素Ⅱ發(fā)揮升壓作用,其中已被證實(shí)SFO與AngⅡ作用致升壓效應(yīng)有關(guān)系[13]。

    PVN和SON腦區(qū)存在大量AVP、OXT神經(jīng)元,負(fù)責(zé)產(chǎn)生和調(diào)控此類(lèi)激素的釋放。本研究結(jié)果顯示Dex組PVN、SON腦區(qū)c-Fos細(xì)胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記數(shù)與OXT神經(jīng)元比例無(wú)差異性,但共標(biāo)記數(shù)與c-Fos細(xì)胞數(shù)量比例降低。結(jié)果分析是Dex組SON腦區(qū)的c-Fos細(xì)胞表達(dá)數(shù)量較Saline組增高,Saline組激活的多數(shù)c-Fos細(xì)胞和OXT神經(jīng)元進(jìn)行共標(biāo)記,但Dex組增加的c-Fos細(xì)胞并未和OXT神經(jīng)元更多地進(jìn)行共標(biāo)記,這一結(jié)果表明,Dex可能并不會(huì)對(duì)小鼠機(jī)體的OXT神經(jīng)元產(chǎn)生影響,但增加的c-Fos細(xì)胞和哪類(lèi)神經(jīng)元進(jìn)行共標(biāo)記,還需進(jìn)一步研究。

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