抗病毒納米顆粒疫苗的研究進(jìn)展

張玉琴，孫業(yè)平，齊建勛

（中國科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

從18世紀(jì)末英國醫(yī)生愛德華·詹納發(fā)現(xiàn)接種牛痘可保護(hù)人類免受天花病毒感染開始，疫苗學(xué)正式誕生。在路易斯·巴斯德等科學(xué)家們的推動(dòng)下，疫苗的概念得到進(jìn)一步的推廣。經(jīng)過200多年的發(fā)展，疫苗接種已成為當(dāng)今防控傳染病最為經(jīng)濟(jì)有效的方式之一。迄今為止，疫苗可以預(yù)防30多種傳染病，是人類醫(yī)學(xué)史上最重要的里程碑[1]。盡管如此，在疫苗研發(fā)過程中仍面臨挑戰(zhàn)：艾滋病、肺結(jié)核等疾病仍然嚴(yán)重威脅全人類的生命財(cái)產(chǎn)安全；流感病毒、新型冠狀病毒的突變速度之快，嚴(yán)重影響了原有疫苗的保護(hù)效果。這再一次使人們認(rèn)識(shí)到，盡快研發(fā)出一款對(duì)新出現(xiàn)的和可能再次出現(xiàn)的病毒均有效果的通用疫苗是十分重要的。此外，現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗存在缺陷，例如減毒活疫苗雖然保留了較高的免疫原性，但存在逆轉(zhuǎn)為高致病性病原的風(fēng)險(xiǎn)[2]。滅活疫苗在制作過程中往往需要加入抗原以外的復(fù)雜成分，存在引發(fā)未知風(fēng)險(xiǎn)的可能性，且在滅活過程中疫苗會(huì)喪失大部分抗原表位，只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較弱的免疫反應(yīng)，通常需要多次給藥或使用佐劑輔助?？贵w依賴性增強(qiáng)（antibody dependent enhancement ，ADE）也是減毒活疫苗和滅活疫苗需要解決的另一個(gè)問題[3]。亞單位疫苗在近幾年的研究中獲得較多的關(guān)注。亞單位疫苗通過體外蛋白純化獲得病毒抗原，與其他疫苗相比，它不含任何遺傳物質(zhì)，因此具有更高的安全性；但亞單位疫苗的缺點(diǎn)是免疫原性差，需要佐劑輔助和重復(fù)接種。納米技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了亞單位疫苗的不足?；诩{米顆粒所研發(fā)的納米顆粒疫苗不僅保持了亞單位疫苗的安全性，還提高了免疫原性和穩(wěn)定性，這就解決了傳統(tǒng)疫苗的大部分局限性，因此納米顆粒疫苗被認(rèn)為是極具潛力的疫苗研發(fā)平臺(tái)。

納米顆粒疫苗主要通過3種方法遞呈所攜帶的抗原（見圖1），分別是共價(jià)結(jié)合、吸附（在納米顆粒表面）和包封（在納米顆粒內(nèi)）。納米顆粒疫苗的優(yōu)勢主要在于其尺寸，其納米級(jí)的大小可匹配大多數(shù)感染性病毒，因此無需佐劑，其免疫原性就接近天然病毒。同時(shí)在給藥時(shí)，納米顆粒疫苗可輕易穿透毛細(xì)血管和黏膜細(xì)胞表面，這使疫苗的給藥方式不再局限于注射，還可以通過鼻腔給藥，這可有效激活黏膜免疫，大大提高了免疫效率。除尺寸大小外，隨著化學(xué)技術(shù)和生物工程的進(jìn)步，納米顆粒的形狀、溶解度、表面性質(zhì)和親水性等均可調(diào)節(jié)和控制，從而制備具有特定生物特性的納米顆粒，最終達(dá)到增強(qiáng)抗原遞呈和獲得強(qiáng)大的免疫原性的目的。研究表明，納米顆?？善鸬綍簳r(shí)的抗原存儲(chǔ)作用，一方面可防止抗原在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)之前被蛋白酶降解，另一方面可確保將抗原持續(xù)地遞呈給免疫細(xì)胞。最重要的是，攜帶抗原的納米顆粒疫苗可調(diào)節(jié)個(gè)體的免疫反應(yīng)以獲得理想的效果，這是納米顆粒疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)[4]，也是所有疫苗研發(fā)的最終目的。目前，超過26種候選納米顆粒疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，另有60種處于臨床前開發(fā)階段[5]。本文重點(diǎn)介紹納米顆粒疫苗的優(yōu)勢，比較全面地總結(jié)目前應(yīng)用較多的納米顆粒疫苗研發(fā)載體，旨在為新型抗病毒疫苗的研發(fā)提供參考。

圖1 納米顆粒疫苗遞呈病毒抗原的3種方法Figure 1 Three ways to present viral antigens in nanoparticle vaccines

1 納米顆粒疫苗給藥方式

傳統(tǒng)疫苗通常采用的給藥方式為肌肉或皮下注射，因?yàn)槟軌蛘T導(dǎo)血清免疫球蛋白G（IgG）的產(chǎn)生。然而對(duì)于呼吸道病毒感染來說，最好的給藥方式是鼻腔或肺部黏膜給藥，這是由于呼吸道病毒或細(xì)菌是通過肺黏膜感染人類。黏膜免疫系統(tǒng)是人體內(nèi)免疫系統(tǒng)的第一道防線，是人體免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，在抗擊感染方面發(fā)揮重要作用，因此有效激活黏膜免疫，誘導(dǎo)分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的產(chǎn)生是對(duì)抗呼吸道病毒的最佳方法。然而黏膜給藥要求疫苗不含任何可能會(huì)在給藥部位引起炎癥反應(yīng)的佐劑，傳統(tǒng)疫苗通常無法滿足這一要求。納米顆粒疫苗由于大小接近天然病毒，免疫原性較高，無需佐劑就能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，且納米級(jí)顆?？奢p易穿透毛細(xì)血管和黏膜細(xì)胞表面（見圖2A），因此是作為黏膜給藥的首選疫苗。Kurosaki等[6]將納米顆粒疫苗經(jīng)肺給藥成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜免疫。Zhao等[7]的研究也證明，通過鼻腔給藥的殼聚糖納米顆粒能夠增強(qiáng)雞的黏膜免疫應(yīng)答。

2 納米顆粒疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié) 機(jī)制

疫苗接種的主要目的是激活個(gè)體或群體免疫系統(tǒng)的先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，以獲得長期的保護(hù)性免疫[8]，因此是否能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生是疫苗開發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵參考因素。與其他疫苗相比，納米顆粒疫苗在刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面具有許多理論優(yōu)勢，包括增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）對(duì)納米顆粒的捕獲、通過受體交聯(lián)激活抗原特異性B細(xì)胞的活化，以及通過淋巴循環(huán)將抗原定位在濾泡樹突狀細(xì)胞（follicular dendritic cell，F(xiàn)DC）處，促進(jìn)抗原遞呈。

2.1 增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞對(duì)納米顆粒的捕獲

病原體進(jìn)入人體內(nèi)首先被巨噬細(xì)胞（macrophage，Mφ）等APC捕獲，之后APC將病原體樣本遞呈給T細(xì)胞，并攜帶病原體樣本至淋巴結(jié)，被B細(xì)胞識(shí)別，最終激活機(jī)體免疫應(yīng)答，清除病原體。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）作為重要的APC在這個(gè)過程中發(fā)揮著核心作用，因此DC是疫苗接種的主要靶細(xì)胞。納米顆粒疫苗通過影響DC在抗原遞呈中的功能，來影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)，這主要得益于納米技術(shù)的進(jìn)步。通過納米技術(shù)可將納米顆粒改造成需要的尺寸、形狀、表面特性等，而這些特性會(huì)影響DC對(duì)納米顆粒的攝取程度，最終達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的目的[9]。尺寸約為100 nm的納米顆粒非常有利于DC的攝取。這是由于大小在100 nm左右的納米顆?？梢宰杂闪魅肓馨徒Y(jié)，并暴露給在此常駐的DC[10]。此外，納米顆粒的表面電荷和形狀也會(huì)影響DC對(duì)納米顆粒的攝取。由于細(xì)胞膜的陰離子特性，帶正電的納米顆粒更易被DC攝取。相對(duì)于棒狀或其他形狀的納米顆粒，球形的納米顆粒更易被DC攝取[11]。此外，也可以在納米顆粒疫苗的制作過程中加入模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）激動(dòng)劑，如Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）等，誘導(dǎo)APC的成熟。研究表明，在納米顆粒疫苗配方中添加PRR激動(dòng)劑可顯著增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答和疫苗的效力[12]。

2.2 刺激B細(xì)胞的活化，增強(qiáng)體液免疫

納米顆粒疫苗主要是通過模擬天然病毒入侵機(jī)體的形式來啟動(dòng)免疫反應(yīng)，將免疫原密集地排列在納米顆粒表面通常能有效地提高其免疫原性，但抗原的表面排列密度很重要。有研究表明，在納米顆粒表面展示人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的包膜糖蛋白（envelope，Env）三聚體，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較天然Env三聚體更有效的中和抗體反應(yīng)。同時(shí)，當(dāng)單個(gè)B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）能夠識(shí)別2個(gè)表面抗原時(shí)，抗原與受體之間的結(jié)合親和力最高[13]。小鼠實(shí)驗(yàn)也證明，納米顆粒表面抗原的密度與小鼠對(duì)呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）免疫原的中和反應(yīng)強(qiáng)度相關(guān)[14]。納米顆粒疫苗還可同時(shí)將多個(gè)抗原遞呈給單個(gè)B細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在單個(gè)納米顆粒上近距離展示多種菌株的流感血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白有利于B細(xì)胞的擴(kuò)增，B細(xì)胞通過識(shí)別不同菌株之間保守的抗原表位，產(chǎn)生對(duì)不同菌株均有預(yù)防效果的中和抗體[15]，這也為流感通用疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

抗原的重復(fù)排列是病原體表面的一種自然特征，它比隨機(jī)聚集的抗原更能刺激B細(xì)胞反應(yīng)。這說明對(duì)稱性也是刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的一個(gè)重要因素。Kanekiyo等[15]的研究顯示，在納米顆粒上以八面體對(duì)稱排列流感病毒血凝素抗原，證實(shí)了病毒的幾何特征在刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用。此外，納米顆粒還可增強(qiáng)其表面抗原的穩(wěn)定性，維持其所需的天然構(gòu)象。

2.3 改變抗原在淋巴結(jié)內(nèi)的遷移和定位，促進(jìn)抗原遞呈

APC在識(shí)別和捕獲抗原后，可遷移至局部淋巴結(jié)，其遷移的部位不同，對(duì)之后的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的影響也不同。對(duì)于體液免疫而言，抗原主要定位在濾泡和生發(fā)中心（germinal center，GC），這是由于體液免疫所需要的B細(xì)胞需要在此增殖和突變。FDC在生發(fā)中心中發(fā)揮著重要作用，它將特定抗原持續(xù)性遞呈給B細(xì)胞。因此，將抗原定位于淋巴結(jié)的FDC處是有效啟動(dòng)體液免疫的重要步驟。科學(xué)家們?cè)谘芯靠扇苄院皖w粒性HIV-Env免疫原的淋巴結(jié)定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，以納米顆粒形式展現(xiàn)的Env三聚體免疫原會(huì)改變其在淋巴結(jié)內(nèi)的遷移和定位?？扇苄訦IV gp120或gp140三聚體抗原主要定位于濾泡間區(qū)域，集中在表達(dá)SIGN-R1（識(shí)別病毒的多種突變，指導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，消除病毒）的巨噬細(xì)胞上。然而納米顆粒形式的gp120或Env三聚體在免疫后幾天內(nèi)主要集中在FDC上，并與新生的GC共定位[16]。此外，納米顆粒的大小也會(huì)影響其定位。直徑小于15 nm的納米顆粒在免疫后可迅速進(jìn)入淋巴結(jié)濾泡間區(qū)，但48 h后就會(huì)被清除。相比之下，直徑為50 ～ 100 nm的納米顆粒在免疫后12 h內(nèi)進(jìn)入濾泡，但可在此處持續(xù)數(shù)周。組織學(xué)染色也證實(shí)這些納米顆粒在后期可以與FDC和GC共定位[17]。這表明在未來的疫苗研發(fā)過程中，可以考慮通過構(gòu)建納米顆粒的形式來促進(jìn)抗原向FDC的遷移。

3 納米顆粒疫苗有助于抗原的遞呈和藥物的遞送

在向人體內(nèi)輸送抗原或藥物的過程中，由于其自身溶解度、吸收率、靶向性以及易降解等特性的限制，抗原或藥物通常很難高效率地到達(dá)需要其發(fā)揮作用的地方，尤其是病毒核酸。與蛋白質(zhì)不同，核酸高度不穩(wěn)定，在體內(nèi)易被核酸酶降解。例如mRNA是一種帶負(fù)電荷的大分子，不能通過細(xì)胞膜擴(kuò)散，但它必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能被翻譯為蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮疫苗的防御效果。納米顆粒技術(shù)的發(fā)展在一定程度上改善了這些問題，這主要得益于納米顆粒的穩(wěn)定性以及其制備的多樣性，尤其是通過調(diào)節(jié)納米顆粒的電荷屬性來幫助疫苗和藥物內(nèi)體逃逸。

納米顆粒在進(jìn)入人體后，通過細(xì)胞胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。被包裹在內(nèi)體中的納米顆粒面臨著2種命運(yùn)，一種是通過胞吐作用被排出細(xì)胞，另一種是囊泡被溶酶體中的酶降解，納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞。為了發(fā)揮疫苗的作用，必須要通過溶酶體途徑將納米顆粒轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中。提示，納米顆粒內(nèi)體逃逸的重要性[18]。帶正電的納米顆?？梢酝ㄟ^靜電相互作用與帶負(fù)電的mRNA形成復(fù)合體，包裹mRNA，保護(hù)mRNA不被核酸酶降解。此外，陽離子納米顆粒在破壞內(nèi)體膜的穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。在低PH值的內(nèi)體內(nèi)，帶正電的納米顆?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)非雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成來破壞內(nèi)體膜，從而使藥物或抗原進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中（見圖2B）。

圖2 納米顆粒疫苗穿透黏膜細(xì)胞及內(nèi)體逃逸Figure 2 Nanoparticle vaccines penetrate mucosal cells and escape from endosomes

4 常用的納米顆粒疫苗載體

4.1 脂質(zhì)納米顆粒

脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）是由磷脂、膽固醇和其他分子組成的單層或多層的球形囊泡，LNP可被用于在表面呈現(xiàn)病毒抗原或在內(nèi)部包裹病毒抗原。通過改變LNP合成過程中使用的每種脂質(zhì)的類型和比例，可以調(diào)整LNP的性質(zhì)以滿足不同的要求[19]。LNP通常直徑為80 ～ 200 nm，這與大部分病毒大小一致，因此其自身就具有強(qiáng)大的免疫原性，無需額外的佐劑[20]。通過微流控設(shè)備也能夠快速有效地混合LNP成分，以生成尺寸可控的LNP。LNP在低pH值下帶正電，可以包裹帶負(fù)電的mRNA，這在協(xié)助納米顆粒內(nèi)體逃逸方面發(fā)揮重要作用。LNP的優(yōu)點(diǎn)在于可以在體外合成和制造，而不需要活細(xì)胞的參與。LNP已被廣泛應(yīng)用于mRNA-LNP疫苗的制作，有些mRNA-LNP疫苗已進(jìn)入臨床階段。例如，由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的S蛋 白mRNA與LNP共 同 制 成 的BNT162b2 mRNA-LNP疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，與未接種該疫苗的受試者相比，接種2針劑該疫苗可保護(hù)受試者免受SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1株）的感染，其有效率可超過90%，且發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)的概率較低[21]。同樣的研究結(jié)果在以色列的研究中也被觀察到[21]。在美國，mRNA-LNP疫苗可保護(hù)超過94%的65歲以上的老人避免因2019新型冠狀病毒?。–OVID-19）相關(guān)疾病而住院[22]。Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示，經(jīng)mRNALNP疫苗免疫后的中和抗體反應(yīng)持久，在所有健康成人參與者體內(nèi)可存在6個(gè)月[23]。通過LNP在表面展示HIV包膜蛋白Env制成的HIV納米顆粒疫苗也被證明有良好的效果。研究發(fā)現(xiàn)，HIV脂質(zhì)體納米顆粒疫苗在B細(xì)胞活化方面優(yōu)于可溶性Env三聚體。當(dāng)給恒河猴注射脂質(zhì)體納米顆粒疫苗后，生發(fā)期卵泡輔助性T細(xì)胞和生發(fā)中心增殖性B細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，這在可溶性Env三聚體未見[3]。此外，與可溶性Env三聚體相比，Env-LNP疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體（neutralizing antibody，NAb）的反應(yīng)較可溶性Env三聚體要高[24]。然而，LNP疫苗仍存在一些缺點(diǎn)，例如通過非共價(jià)連接抗原時(shí)，該疫苗在體內(nèi)不穩(wěn)定，無法有效保留其表面的抗原蛋白?？乖悸?lián)效率、大小、顆粒完整性和均一性仍是需要解決的問題（見表1）。此外，mRNA-LNP疫苗需要冷鏈儲(chǔ)存（＜ －20℃），這限制了其在基礎(chǔ)設(shè)施不發(fā)達(dá)地區(qū)的部署。

4.2 有機(jī)聚合物納米顆粒

有機(jī)聚合物納米顆粒是由有機(jī)單體單元構(gòu)成的大分子固體顆粒。與無機(jī)納米顆粒相比，有機(jī)聚合物納米顆粒具有更高的免疫原性、更好的靶向性和可降解性，因此在疫苗的開發(fā)中具有特別重要的意義。由于有機(jī)聚合物納米顆粒具有優(yōu)異的生物相容性和較大的比表面積，可輕松地將病毒抗原裝入其核心或吸附在其表面，從而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高強(qiáng)度的免疫反應(yīng)的目的[25]，因此有機(jī)聚合物很早就被廣泛應(yīng)用于納米顆粒疫苗的制備。根據(jù)來源不同，有機(jī)聚合物可分為天然聚合物、半合成聚合物及合成聚合物，它們各有優(yōu)勢。例如，天然聚合物納米材料具有比合成聚合物納米材料更好的生物相容性，因?yàn)榍罢呤窃谧匀唤缰刑烊淮嬖诘?，例如，殼聚糖、海藻酸鈉和纖維素等。然而合成聚合物納米顆粒具有可定制的化學(xué)、生物特性，比天然聚合物納米顆粒更能滿足需求，例如聚乳酸-乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）和聚乙二醇（polyethylene glycol ，PEG）等。

殼聚糖是一種天然陽離子多糖，通過靜電相互作用與質(zhì)粒DNA或其他帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。同時(shí)，帶正電的殼聚糖可以與帶負(fù)電的唾液酸產(chǎn)生靜電相互作用，促進(jìn)鼻腔給藥后納米顆粒在氣道上皮細(xì)胞表面的黏附。殼聚糖納米顆粒的表面可用甘露糖修飾。甘露糖的先天免疫識(shí)別可能有助于更多的納米顆粒穿梭于FDC網(wǎng)絡(luò)，并遷移至淋巴結(jié)的生發(fā)中心[16]。Zhang等[26]研究了殼聚糖納米顆粒疫苗的抗RSV感染的效果。該研究采用殼聚糖納米顆粒攜帶靶向NS1基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）制成RSV納米顆粒疫苗，通過鼻內(nèi)給藥，注射到被RSV感染的小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，在注射疫苗后，小鼠體內(nèi)RSV復(fù)制明顯減少，Ⅰ型干擾素含量升高，CD4+T細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞Ⅰ型分化，這表明殼聚糖納米顆?？杀Ｗo(hù)小鼠抵御RSV感染。PLGA是一種高度可生物降解的合成聚合物，可在體內(nèi)水解成無毒的乙醇酸鹽和乳酸，安全地被排出體外。此外，PLGA還可被定制成各種所需要的大小和形狀，控制抗原釋放速率。因此，PLGA納米顆粒也被用于抗病毒納米顆粒疫苗的研發(fā)。Dhakal等[27]已研發(fā)出包裹滅活豬流感病毒H1N2抗原KAg的PLGA納米顆粒疫苗，并在豬模型中評(píng)估了其免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻接種PLGA-KAg疫苗的豬表現(xiàn)出免疫細(xì)胞增殖增強(qiáng)的現(xiàn)象，與存在發(fā)熱的對(duì)照組豬相比，接種PLGA-KAg疫苗的豬未表現(xiàn)出臨床流感癥狀。Galloway等[28]的研究還證明，與單獨(dú)的可溶性抗原制成的疫苗相比，裝載流感病毒抗原的PLGA納米顆粒疫苗更安全，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高的免疫反應(yīng)?？傊?，有機(jī)聚合物納米顆粒因其生物相容性、有效的黏附性和生物可降解性及可修飾的物理化學(xué)性質(zhì)（見表1），成為疫苗研發(fā)的有力平臺(tái)。然而由于此類疫苗研究主要集中在流感病毒上，對(duì)其他呼吸道病毒如SARS-CoV-2、RSV等病毒的研究有限，因此還需進(jìn)一步研究。

4.3 病毒樣顆粒

病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）通常是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自組裝形成的非復(fù)制性結(jié)構(gòu)。病毒結(jié)構(gòu)蛋白，如包膜糖蛋白和衣殼蛋白，均可在體外細(xì)胞培養(yǎng)中共表達(dá)并自組裝成顆粒形態(tài)的VLP。VLP可以由重復(fù)的病毒抗原單體自組裝形成，也可以由幾種病毒結(jié)構(gòu)蛋白自組裝形成，由于不含病毒遺傳物質(zhì)，VLP疫苗在保留了重組亞單位疫苗的優(yōu)勢的同時(shí)，還消除了減毒疫苗可能發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)。VLP可以在細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、酵母和植物細(xì)胞中產(chǎn)生。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的VLP疫苗相比，重組桿狀病毒衍生結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的VLP表現(xiàn)出更高和更廣泛的免疫反應(yīng)。VLP的形態(tài)特征與大小模擬了天然病毒的特征，其表面有病毒抗原的重復(fù)結(jié)構(gòu)和自然保留的抗原構(gòu)象，這使得VLP具有較高的免疫原性（見表1），可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。葛蘭素史克（Glaxo Smith Kline）公司開發(fā)的首款乙型肝炎病毒VLP疫苗于1986年商業(yè)化。隨后，其他VLP疫苗也被相繼開發(fā)并商業(yè)化，例如葛蘭素史克公司的人乳頭瘤病毒疫苗Cervarix、默克（Merck & Co. Inc）公司的乙型肝炎病毒疫苗Recombivax HB和人乳頭瘤病毒疫苗Gardasil。此外，流感病毒的VLP疫苗也在研發(fā)中。研究顯示，H1N1或H3N2流感病毒的VLP疫苗可針對(duì)同源和異源流感病毒抗原產(chǎn)生保護(hù)效果[29]，在小鼠和雪貂模型中流感病毒VLP疫苗針對(duì)同源和異源病毒能夠產(chǎn)生有效的血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）滴度。Geng等[30]研發(fā)了一種針對(duì)SARS-CoV-2的VLP疫苗，在顆粒表面顯示120個(gè)單位的抗原表位即受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（receptor binding domain，RBD），與普通RBD疫苗相比，VLPRBD疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體是普通RBD疫苗的5倍，且這些中和免疫反應(yīng)可持續(xù)2個(gè)月。這些結(jié)果表明，VLP疫苗也是有潛力的疫苗研發(fā)平臺(tái)，但目前針對(duì)VLP疫苗的結(jié)果均是在小鼠模型中得到，在人類體內(nèi)是否會(huì)產(chǎn)生同樣的效果尚未知，因此還需要進(jìn)一步的研究。

4.4 自組裝蛋白

自然界中有許多天然存在的可自組裝成納米顆粒的蛋白質(zhì)，其所含有的自組裝基序使可溶性蛋白自組裝成蛋白質(zhì)納米顆粒。自組裝蛋白通常由多個(gè)重復(fù)的亞單位結(jié)構(gòu)組成，形狀不一，如籠狀、管狀、線狀和環(huán)狀等，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征、對(duì)稱性和相對(duì)易于修飾的特點(diǎn)，它們可以很容易地與蛋白質(zhì)、肽和合成分子等相融合，因此此類蛋白質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于生物分子工程和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[31]。自主裝蛋白最大的特點(diǎn)是可以在表面同時(shí)展示不同種類的抗原表位（見表1），因此其可被用于制備抵御多種病毒感染的多價(jià)疫苗。鐵蛋白（ferritin）是細(xì)胞內(nèi)具有儲(chǔ)存鐵功能的蛋白質(zhì)，在許多組織中均有表達(dá)。鐵蛋白能夠自組裝成具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)和有序矩陣的球狀納米籠。鐵蛋白納米顆粒自排列為八面體，由8個(gè)三聚體單元組成，允許三聚體抗原在納米顆粒表面以天然構(gòu)象呈現(xiàn)。由于鐵蛋白具有耐熱和耐化學(xué)應(yīng)力的特點(diǎn)，其被廣泛應(yīng)用于疫苗研發(fā)。在HIV疫苗的研發(fā)過程中，He等[32]和Sliepen等[33]的研究均表明，與普通Env三聚體疫苗相比，裝載Env三聚體的鐵蛋白納米顆粒疫苗能夠在家兔體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的中和抗體。Joyce等[34]利用鐵蛋白研發(fā)的SARS-CoV-2納米顆粒疫苗也被證明能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體滴度。此外，其他自組裝蛋白如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、E2蛋白等，也是納米顆粒疫苗研發(fā)的有效載體。

除天然存在的自組裝蛋白外，基于計(jì)算設(shè)計(jì)產(chǎn)生的體外自組裝蛋白也在疫苗研發(fā)過程中得到廣泛應(yīng)用。體外組裝的納米顆?？梢愿玫乜刂瓶乖鞍椎馁|(zhì)量，因?yàn)樵诮M裝之前可以對(duì)抗原蛋白進(jìn)行純化[35]。目前應(yīng)用較多的體外組裝納米顆粒有通過SpyCatcher和SpyTagged共價(jià)偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，以及I53-50納米顆粒。尤其是后者，有研究證明SARSCoV-2和RSV的I53-50納米顆粒疫苗能有效誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[36]。對(duì)家兔模型的免疫研究表明，通過I53-50展示HIV包膜蛋白的納米顆粒（Env-I53-50NPs）的免疫原性與普通Env相比顯著增強(qiáng)。此外，Env-I53-50NPs在促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體方面優(yōu)于Env鐵蛋白納米顆粒[35]。因此可以推測，體外組裝的納米顆粒將對(duì)下一代疫苗產(chǎn)生越來越大的影響。無論是體內(nèi)組裝還是體外組裝的納米顆粒，均可能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)其自身的抗體反應(yīng)。鐵蛋白納米顆粒疫苗和I53-50納米顆粒疫苗均能夠引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)其自身的中和抗體的反應(yīng)[37]，這不會(huì)影響其針對(duì)RSV和流感病毒的中和抗體反應(yīng)，但可能會(huì)干擾抗HIV-1的中和抗體反應(yīng)[38]。

肽自組裝是一個(gè)涉及化學(xué)、生命科學(xué)和材料科學(xué)的跨學(xué)科研究領(lǐng)域。肽可以通過計(jì)算從頭設(shè)計(jì)，也可以從天然蛋白質(zhì)序列中提取，是制備納米結(jié)構(gòu)的一類重要分子構(gòu)件[39]。由于肽本身在生物合成過程中和生物合成后易于修飾的特點(diǎn)，肽也被用來研發(fā)納米顆粒疫苗。自組裝肽水凝膠作為一種可注射的多功能支架材料在藥物釋放和組織再生方面顯示出巨大的發(fā)展前景[40]。人工合成的β-折疊自組裝肽能夠起到穩(wěn)定抗原并增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用。研究人員合成了一種自組裝的嵌合肽，該嵌合肽為十聚體，每個(gè)單體包含一個(gè)β-折疊序列和甲型流感病毒的高度保守表位M2e，最終形成一個(gè)100～200 nm的均勻納米棒（nanorods，NR），M2e表位位于其表面。結(jié)果顯示，M2e-NRs被抗原遞呈細(xì)胞有效攝取，在小鼠體內(nèi)顯示出強(qiáng)烈的M2e特異性IgG反應(yīng)[40]。

4.5 無機(jī)納米顆粒

目前有許多無機(jī)納米顆粒被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)。然而，由于顆粒聚集的特性，普通無機(jī)納米顆粒本身不適合用于生物流體。因此，在醫(yī)療領(lǐng)域，這些納米顆粒通常通過吸附或化學(xué)反應(yīng)被有機(jī)分子包裹，故稱其為具有無機(jī)核和有機(jī)外殼的混合納米顆粒。在無機(jī)納米顆粒中，最常用于疫苗接種的是金納米顆粒（Au nanoparticle，AuNP）。AuNP很容易被Mφ和DC內(nèi)化，并誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞的激活。包括佐劑和抗原等多種分子，均可以高密度結(jié)合在AuNP上，從而提高納米顆粒的免疫原性和抗原遞呈效率。AuNP可經(jīng)鼻內(nèi)給藥，擴(kuò)散至淋巴結(jié)，觸發(fā)強(qiáng)烈的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫反應(yīng)[41]。盡管AuNP構(gòu)成了一個(gè)有吸引力的疫苗研發(fā)平臺(tái)，但它們可在肝和脾等器官中長期積累，可能具有毒性。用生物相容性材料涂層可降低其毒性，但這可能會(huì)導(dǎo)致納米顆粒物理化學(xué)和生物特性的改變。因此，AuNP的安全問題仍然需要解決（見表1）。除AuNP外，銀納米顆粒（Ag nanoparticle，AgNP）也被用于疫苗的研發(fā)。Pilaquinga等[42]的研究表明，AgNP在治療SARS-Cov-2方面有效，且在通過吸入給藥時(shí)副作用最小。

4.6 噬菌體蛋白質(zhì)外殼

噬菌體是一類可感染細(xì)菌但不感染人類的病毒。每種噬菌體均有自己獨(dú)特的大小和形狀，但通常呈對(duì)稱結(jié)構(gòu)，因此其可被開發(fā)用作某些病毒疫苗的載體，預(yù)防多種傳染病。P22噬菌體由一個(gè)60 nm的二十面體衣殼和一個(gè)尾部區(qū)域組成。研究人員利用P22噬菌體開發(fā)了一種流感病毒PR8特異性疫苗，將血凝素蛋白的球狀頭部結(jié)構(gòu)域通過連接酶連接到P22噬菌體外殼上，將該疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，然后用PR8甲型流感病毒對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊，最終接種疫苗的小鼠存活率為100%，而未接種的小鼠存活率為50%。此外，與對(duì)照組相比，該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原特異性IgG抗體水平提高了一倍[43]。Qβ是一種具有二十面體外殼的噬菌體，長約25 nm。Qβ已被用作傳染病和癌癥的疫苗支架[44]，如流感、瘧疾等。在最近的一項(xiàng)研究中，研究人員通過基因工程和化學(xué)結(jié)合的方法，開發(fā)了幾種在Qβ外殼上展示HIV-1抗原的方法。經(jīng)過為期6個(gè)月的家兔實(shí)驗(yàn)后，該研究發(fā)現(xiàn)在Qβ外殼上展示全長HIV-1抗原，可產(chǎn)生更高的中和抗體滴度[45]。噬菌體T4目前也被用于應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2，其為核酸疫苗提供載體，保護(hù)病毒核酸不被降解，并模擬天然病毒入侵機(jī)制確保核酸的有效遞送，但也存在病毒載體本身可能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的缺點(diǎn)（見表1）。

4.7 去溶劑化納米顆粒

蛋白質(zhì)溶液中物理化學(xué)條件的變化可以驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)納米顆粒的形成。脫溶劑化形成的納米顆粒的尺寸為50～300 nm。由于物理化學(xué)條件的變化是動(dòng)態(tài)過程，因此以這種方式組裝的納米顆粒通常大小不均勻，但可顯示出正態(tài)分布的大小范圍。通過乙醇去溶劑化可將流感病毒抗原M2e或流感病毒HA自組裝成蛋白質(zhì)納米顆粒。由于這些去溶劑化納米顆粒完全是由抗原成分組裝的，且為完全可溶的結(jié)構(gòu)，因此在所有蛋白質(zhì)納米顆粒中，這種納米顆粒的抗原載量最高（見表1）。去溶劑化納米顆粒的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可與不同的抗原蛋白質(zhì)一起經(jīng)歷多個(gè)顆粒組裝過程周期。由于不同的抗原蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不同及理化性質(zhì)差異，脫溶劑化可使它們?cè)诩{米顆粒核心外形成不同的片層，產(chǎn)生多層納米顆粒，從而將抗原蛋白組裝到顆粒周圍的不同片層中。研究人員已利用乙醇將流感病毒抗原M2e脫溶劑化形成的納米顆粒作為核心，并在外層通過化學(xué)交聯(lián)連接結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的流感病毒HA柄，制備了雙層蛋白質(zhì)納米顆粒。這種分層的蛋白質(zhì)納米顆?？梢宰畲笙薅鹊匕l(fā)揮不同抗原的不同免疫作用。小鼠皮膚免疫實(shí)驗(yàn)表明，這種蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗可以對(duì)各種流感病毒產(chǎn)生普遍免疫，且免疫效果能維持4個(gè)月[46]。

表1 各類納米顆粒疫苗優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of various nanoparticle vaccines

5 針對(duì)SARS-CoV-2的納米顆粒疫苗的臨床進(jìn)展

自2019年COVID-19疫情暴發(fā)至今，有各類針對(duì)SARS-CoV-2的納米顆粒疫苗正在研發(fā)過程中，如mRNA-LNP疫苗、病毒樣顆粒疫苗和自組裝納米顆粒疫苗等。有部分疫苗已進(jìn)入臨床階段并取得優(yōu)異的結(jié)果。除前文已述的BNT162b2 mRNA-LNP疫 苗 外，Baden等[20]研 發(fā) 的mRNA-1273新 冠 病毒疫苗，也是一種LNP疫苗。該試驗(yàn)共招募了30420名志愿者，以1∶1的比例隨機(jī)分配，分別注射疫苗或安慰劑。最終結(jié)果證明，該疫苗預(yù)防SARSCoV-2的有效率達(dá)到94.1%，且暫未發(fā)現(xiàn)任何安全問題。Keech等[47]研發(fā)的NVX-CoV2373是一種由SARS-CoV-2的三聚體全長S蛋白與Matrix-M1佐劑共同組成的納米顆粒疫苗。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，該疫苗的安全性良好，注射該疫苗后大部分受試者無明顯不良反應(yīng)或只表現(xiàn)出輕微不良反應(yīng)；該疫苗有效性良好，在注射2針劑5 μg該疫苗后，受試者體內(nèi)均產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。

6 結(jié)語與展望

盡管病原體各不相同，但傳染性病毒均有共同的特點(diǎn)：已知病毒重新出現(xiàn)的不可預(yù)測性，以及未知病毒導(dǎo)致新疾病出現(xiàn)的不可預(yù)測性、高發(fā)病率和深刻的社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響，這也強(qiáng)調(diào)了研發(fā)通用疫苗的重要性。納米技術(shù)的發(fā)展為盡早解決這一問題提供了新的思路。納米顆粒疫苗因其具有與天然病毒類似的結(jié)構(gòu)、安全性好、免疫原性良好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及獨(dú)特的顯示外源蛋白的能力，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中[48]。基于納米顆粒的疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的更強(qiáng)大的保護(hù)性抗體，因此納米顆粒疫苗是一種強(qiáng)大而靈活的疫苗研發(fā)平臺(tái)。然而，盡管納米顆粒疫苗已展示出巨大的發(fā)展前景，仍有一些缺點(diǎn)不可忽視。首先關(guān)于納米顆粒疫苗的設(shè)計(jì)尚未探索到最有效的設(shè)計(jì)方案，其靶向、生物分布和代謝清除等還需進(jìn)一步研究。其次，實(shí)現(xiàn)納米顆粒疫苗大規(guī)模的生產(chǎn)及可持續(xù)、可重復(fù)性的問題仍待解決。再次，目前世界上針對(duì)病毒的疫苗的部署仍存在不公平的現(xiàn)象，就以SARS-CoV-2疫苗的部署來說，在高收入和中等收入國家的覆蓋率較高，而低收入國家的部署才剛剛開始。因此在疫苗的研發(fā)過程中，成本是必須要考慮的問題。此外，納米顆粒疫苗研發(fā)平臺(tái)需要專業(yè)的生產(chǎn)設(shè)施和高技能的勞動(dòng)力，這對(duì)一些資源有限的國家也是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。最后是疫苗的運(yùn)輸與存儲(chǔ)問題，目前大部分疫苗都需要冷鏈儲(chǔ)存，這也使疫苗的生產(chǎn)、分銷變得復(fù)雜。然而隨著科技的進(jìn)步，這些問題也在逐漸解決?？傊?，納米顆粒疫苗是對(duì)抗傳染性病毒的有效手段，相信在不久的將來，能夠通過其改善全人類的生命健康。