牛源益生性優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選

丁 媛，鄭博予，祁宏偉

吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，吉林公主嶺 136100

乳酸菌能夠促進動物體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還能通過抑制有害菌株的生長繁殖，從而維持機體內(nèi)微生物菌群的平衡，誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)來增強機體自身的免疫能力。本文通過對其生理生化、耐酸、耐膽鹽等方面進行鑒定從而篩選出優(yōu)勢牛源乳酸菌作為出發(fā)菌，為下一步發(fā)酵工藝條件研究、優(yōu)化以及微生態(tài)制劑制備提供了優(yōu)良的出發(fā)菌種。

1 材料

糞便樣品采集于吉林省公主嶺市張家街牛場健康成年牛的新鮮糞便；抑菌試驗所用菌株：致病菌菌株均由本實驗室保存；40只昆明小鼠（20±2 g）購自南京青龍山動物飼養(yǎng)場。

2 方法

2.1 樣品采集和處理

將牛新鮮糞便樣本稀釋涂布于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。對單菌落進行平板劃線法純化后，放置-80 ℃冰箱備用。

2.2 疑似乳酸菌的形態(tài)及生理、生化特征鑒定

顯微鏡鏡檢觀察菌體的形態(tài)，對疑似乳酸菌進行鑒定。

2.3 疑似乳酸菌生長特性鑒定

2.3.1 菌液活化后經(jīng)梯度稀釋后接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于不同溫度下培養(yǎng)7 d，測定OD600值。

2.3.2 使用HCl溶液和NaOH溶液將配好的MRS液體培養(yǎng)基調(diào)至不同pH值，接種疑似單菌落，培養(yǎng)7 d后，測定OD600值。

2.3.3 向MRS液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl后接種菌，培養(yǎng)7 d，測定OD600值。

2.4 16 S rRNA 基因序列的測定與細菌鑒定

將純化后的菌液離心后送去測序。

2.5 生長曲線及產(chǎn)酸曲線

取1 mL活化后的菌液加入裝有100 mLMRS液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，分別于1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24 h時測定菌液OD600的吸光值和pH值，并倍比稀釋涂板計數(shù)。以MRS液體培養(yǎng)基為陰性對照。

2.6 耐受性

通過調(diào)整培養(yǎng)基pH、添加0.5%膽鹽以及使用特定菌測定其耐受性[1]。

3 結(jié)果

3.1 篩選

從健康肉牛的新鮮糞便中共篩選出20株疑似乳酸菌菌株，20株疑似乳酸菌菌株中桿菌共有15株、球菌共有5株，命名為Z1～Z20。

3.2 形態(tài)、生理生化特征鑒定

通過對疑似乳酸菌菌株形態(tài)以及生理生化特征上的鑒定分析最終篩選出5株菌株，分別為Z6、Z8、Z11、Z15、Z18。這5株菌株均為桿狀，且革蘭氏染色均為陽性。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，并且發(fā)酵方式為同型發(fā)酵。

3.3 生長特性鑒定

對這5株植物乳桿菌在不同pH、溫度及鹽度條件下的生長特性進行測定發(fā)現(xiàn)，均能夠在45 ℃的條件下良好生長；4 ℃和6.5% NaCl條件下Z11、Z6和Z18均能夠生長，而其他的菌株呈現(xiàn)微弱生長和不生長；在pH3.0條件下，菌株Z18不生長，菌株Z11和Z15生長，菌株Z6和Z8呈現(xiàn)微弱生長。結(jié)合測定結(jié)果綜合分析選擇Z11進行后續(xù)試驗。

3.4 16S rRNA 基因序列測定

通過16S rRNA基因測序進行分析，并使用Mega 7.0對乳酸菌Z11進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建結(jié)果表明，乳酸菌Z11與植物乳桿菌NRRL B-14768相似度可達100%。

3.5 生長曲線測定以及產(chǎn)酸曲線測定

植物乳桿菌Z11在接種后數(shù)據(jù)表明，4 h時，Z11開始成對數(shù)生長，通過10 h的生長繁殖，在14 h時進入穩(wěn)定期。4 h內(nèi)pH趨于穩(wěn)定，4 h后開始降低，培養(yǎng)至28 h時，pH降至3.96。

3.6 耐受性試驗

在pH3.0條件下，3 h后存活率93.79%。在0.5%膽鹽條件下，0 h菌落數(shù)6.45 lg（CFU/mL），3 h菌落數(shù)為5.54 lg（CFU/mL），存活率為86.31%。在pH3.0與0.5%膽鹽條件下，雖然植物乳桿菌Z11 3 h時菌落數(shù)與0 h相比均為下降趨勢，但0 h與3 h之間的菌落數(shù)均差異不顯著（p＞0.05）。表明Z11對酸性以及膽鹽環(huán)境均有一定的耐受性。

3.7 抑菌性試驗

由表1可知，植物乳桿菌Z11對致病菌均有抑制作用。

表1 Z11對病原菌的抑菌性能

3.8 藥物敏感性試驗

由表2可知：β1內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類以及磺胺類抗生素均可抑制Z11生長。

表2 Z11藥物敏感性能

4 討論

眾所周知，自然環(huán)境中的個體與微生物之間存在著一定的密切關(guān)系才得以維持世間平衡[2]。在微生物的生長過程中，分為適應(yīng)期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個時間段[3]。了解菌株這4個時間段發(fā)生的時間能夠掌握對應(yīng)時間內(nèi)該菌株的生長狀況。李雪莉等[4]試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)有乳酸菌菌株在接種后4 h進入對數(shù)生長期，12 h后達到生長穩(wěn)定期。本試驗根據(jù)對植物乳桿菌Z11生長曲線的研究發(fā)現(xiàn)，在4 h時植物乳桿菌Z11進入了對數(shù)生長期，經(jīng)過10 h的生長繁殖，在14 h后進入了生長穩(wěn)定期，細菌數(shù)較高，穩(wěn)定性較好，可適用于在生產(chǎn)中使用。

發(fā)酵液pH能夠直觀地反映菌株的產(chǎn)酸能力，培養(yǎng)4 h后，植物乳桿菌Z11的pH開始下降，24 h時pH降至3.96，16 h后pH值趨于穩(wěn)定，適合應(yīng)用于微生物菌劑的制備。

Z11在pH為3.0時存活率可達93.79%，0.5%膽鹽條件下存活率可達86.31%，說明植物乳桿菌Z11對于低酸的胃環(huán)境以及膽鹽的腸道環(huán)境均有較好的抵御力。

Z11對常用的抗生素β1內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、硝基呋喃類等常用抗生素敏感。有報道指出乳酸菌具有代替抗生素的潛在作用，原因為在其生長繁殖的過程中能夠產(chǎn)生大量有機酸以及抑菌物質(zhì)。有機酸可以通過降低腸道pH值來改善腸道內(nèi)的內(nèi)環(huán)境，促進優(yōu)勢菌株的生長繁殖，維持腸道內(nèi)的平衡狀態(tài)，抑菌物質(zhì)與酸性環(huán)境結(jié)合可以抑制多種病原性細菌的生長繁殖。本試驗中，Z11對常見病原菌的生長起到抑制作用，這可能與其產(chǎn)酸能力有關(guān)，但乳酸菌生長過程中產(chǎn)生的物質(zhì)較多，是否產(chǎn)生抑菌物質(zhì)從而導(dǎo)致抑制病原菌生長還需深入探究。