天香丹對(duì)冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙大鼠微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的影響

古麗葛娜·薩吾爾，劉 偉，馬學(xué)寬，安冬青，4

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙(CMD)是導(dǎo)致心肌缺血的重要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CMD發(fā)病廣泛但尚缺乏有效治療方案[2]。CMD的發(fā)生主要是由于管徑<500 μm的冠狀動(dòng)脈微血管結(jié)構(gòu)或功能異常，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血流量減少，心肌灌注水平降低[3]。冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)作為冠狀動(dòng)脈微血管的主要組成部分，在維持微血管穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[4]。天香丹為名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，在治療冠心病方面具有較好效果。研究顯示，天香丹可改善冠心病病人心肌缺血癥狀，并保護(hù)血管內(nèi)皮[5-6]，但其對(duì)CMD的作用機(jī)制尚未明確。本研究以CMD大鼠及CMECs損傷模型為研究對(duì)象，探討天香丹對(duì)CMD的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 選取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠53只，體質(zhì)量(200±20)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、天香丹低劑量組、天香丹中劑量組、天香丹高劑量組及尼可地爾組，每組8只。實(shí)驗(yàn)大鼠均購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)環(huán)境為無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：IACUC-20170222027)。CMECs購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司(貨號(hào)：ZQ0882)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 天香丹顆粒購(gòu)自新疆華世丹藥業(yè)有限公司(批號(hào)：新藥制字Z20040820，每袋9 g，含生藥量3.125 g，其藥物成分紅景天∶丹參∶新塔花∶降香為8∶8∶6∶3)；尼可地爾購(gòu)自上海梯希愛(ài)公司。月桂酸鈉粉劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；內(nèi)皮素-1(ET-1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購(gòu)自華聯(lián)生物有限公司；一抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)(ab5589)、一抗CD34(ab81289)、一抗β-actin(ab8227)均購(gòu)自Abcam公司；二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔(PV6001)購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物建模與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉全身，連接呼吸機(jī)輔助通氣。在胸骨左側(cè)第3肋、第4肋間打卡胸腔充分暴露心臟和主動(dòng)脈，使用一次性BD胰島素針迅速將1 mL/kg的月桂酸鈉注入左心室(假手術(shù)組注入等量生理鹽水)，同時(shí)夾閉主動(dòng)脈約10 s，關(guān)閉胸腔，加熱墊保持體溫，回籠復(fù)蘇。手術(shù)全程無(wú)菌操作并由操作熟練的兩名專業(yè)實(shí)驗(yàn)員共同完成。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素8×105U腹腔注射預(yù)防感染，術(shù)后隨機(jī)選5只模型大鼠，并取出心臟組織，以心肌組織石蠟切片HE染色法觀察到微血栓、微血管閉塞視為造模成功。造模完成后，根據(jù)體表面積法[7]，假手術(shù)組給予生理鹽水灌胃，每日2 mL；模型組給予生理鹽水灌胃，每日2 mL；天香丹低劑量組給予天香丹灌胃，每日0.81 g/kg；天香丹中劑量組給予天香丹灌胃，每日1.62 g/kg；天香丹高劑量組給予天香丹灌胃，每日3.24 g/kg；尼可地爾組給予尼可地爾灌胃，每日1.35 mg/kg。均連續(xù)給藥28 d。

1.2.2 心肌微血管超微結(jié)構(gòu)觀察 將新鮮心肌組織約1 mm3切片并于2.5%戊二醛固定液中固定24 h后漂洗、固定、脫水、包埋、切片，在透射電鏡下觀察心肌內(nèi)CMECs超微結(jié)構(gòu)變化并采集圖像。

1.2.3 心肌微血管密度(MVD)測(cè)定 用大鼠心肌組織制作石蠟切片，用CD34免疫組化法標(biāo)記冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)棕色內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇的數(shù)量進(jìn)行定量計(jì)算MVD，每個(gè)組織切片在放大400倍下隨機(jī)選取5個(gè)光學(xué)顯微鏡視野，取平均值作為各樣本的MVD。

1.2.4 脂多糖誘導(dǎo)的CMECs損傷模型建立及分組 用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)CMECs，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法確定脂多糖誘導(dǎo)的CMECs損傷及天香丹作用于CMECs的最佳濃度及時(shí)間。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，對(duì)照組：正常CMECs不進(jìn)行任何干預(yù)；脂多糖組：脂多糖10 μg/mL干預(yù)24 h；天香丹組：天香丹50 μg/mL干預(yù)24 h；脂多糖+天香丹組：脂多糖10 μg/mL和天香丹50 μg/mL同時(shí)干預(yù)24 h。

1.2.5 NO、ET-1水平檢測(cè) 每組各取5只大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心后分離血清，NO、ET-1試劑盒檢測(cè)血清NO、ET-1水平。收集CMECs各組細(xì)胞上清液，用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液NO水平。所有操作均按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組血清NO、ET-1濃度及細(xì)胞上清NO水平。

1.2.6 eNOS蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)心肌切片組織eNOS蛋白表達(dá)情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，以組織出現(xiàn)黃色或棕褐色區(qū)域判斷有陽(yáng)性反應(yīng)，采用Image-Proplus軟件進(jìn)行分析。再?gòu)母鹘M大鼠的心肌組織及各組CMECs中提取蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡法檢測(cè)，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后，加入一抗eNOS(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)二抗孵育后，加入ECL顯色液，凝膠成像系統(tǒng)曝光后，用Image J軟件進(jìn)行eNOS蛋白定量分析。每項(xiàng)檢測(cè)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料多組間比較采用方差分析，若符合正態(tài)分布且方差齊，采用Tukey檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)或Brown-Forsythe檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌微血管結(jié)構(gòu)比較 假手術(shù)組大鼠心肌微血管基底膜正常，內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)腫脹、形態(tài)基本正常；模型組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)增厚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，細(xì)胞核周隙明顯增寬，血管腔內(nèi)存在血栓；天香丹低劑量組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，但血管內(nèi)無(wú)明顯血栓形成；天香丹中劑量組大鼠心肌微血管基底膜輕微皺縮，但內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯腫脹，管腔內(nèi)未見(jiàn)血栓；天香丹高劑量組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯腫脹或皺縮，形態(tài)大致正常，管腔內(nèi)未見(jiàn)血栓；尼可地爾組心肌微血管基底膜可見(jiàn)皺縮，內(nèi)皮細(xì)胞輕微腫脹，血管腔內(nèi)未見(jiàn)血栓。由此可見(jiàn)，天香丹可能通過(guò)減輕微血管內(nèi)皮水腫、減少微血栓而改善模型大鼠心肌微血管結(jié)構(gòu)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠冠狀動(dòng)脈心肌微血管超微結(jié)構(gòu)觀察

2.2 各組大鼠心肌MVD比較 與假手術(shù)組比較，模型組MVD明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，天香丹中劑量組、天香丹高劑量組及尼可地爾組MVD增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，天香丹高劑量組MVD增加最明顯。說(shuō)明天香丹可增加CMD大鼠的微血管密度。詳見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織CD34免疫組化染色圖

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.3 各組大鼠NO、ET-1水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清NO水平降低，ET-1水平升高，NO/ET-1明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示CMD大鼠模型有內(nèi)皮功能損傷；與模型組比較，天香丹中劑量組、天香丹高劑量組及尼可地爾組NO水平及NO/ET-1明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明中、高劑量天香丹及尼可地爾對(duì)CMD大鼠內(nèi)皮功能具有改善作用，其中天香丹中劑量組內(nèi)皮功能改善效果更為明顯。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清NO、ET-1表達(dá)水平()

2.4 各組大鼠心肌eNOS蛋白表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示，eNOS主要在血管內(nèi)皮及其周圍表達(dá)，且與模型組比較，天香丹中劑量組與尼可地爾組eNOS蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，而與尼可地爾組比較，天香丹低劑量組eNOS水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白免疫印跡法檢測(cè)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組eNOS蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，天香丹中劑量組、天香丹高劑量組、尼可地爾組eNOS蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。說(shuō)明天香丹中、高劑量可增加大鼠心肌eNOS的表達(dá)，其表達(dá)水平與尼可地爾相當(dāng)，提示中、高劑量天香丹可提高eNOS的表達(dá)以改善內(nèi)皮功能。詳見(jiàn)圖4～圖7。

圖4 各組大鼠心肌組織eNOS免疫組化染色圖(×200)

與模型組比較，＊ P<0.05，# P<0.01；與尼可地爾組比較，△ P<0.05。

圖6 各組大鼠eNOS蛋白表達(dá)條帶圖

模型組與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，△ P<0.01。

2.5 各組CMECs上清液NO及細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)水平比較 為進(jìn)一步證實(shí)天香丹對(duì)微血管內(nèi)皮功能保護(hù)作用，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)天香丹干預(yù)CMECs后細(xì)胞上清NO水平及細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，脂多糖組細(xì)胞上清液NO水平及細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與脂多糖組比較，脂多糖+天香丹組NO水平、eNOS蛋白表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明天香丹可促進(jìn)CMECs細(xì)胞內(nèi)eNOS表達(dá)及NO的釋放，從而改善內(nèi)皮功能。詳見(jiàn)圖8～圖10。

脂多糖組與對(duì)照組比較，＊ P<0.01；與脂多糖組比較，# P<0.01。

圖9 各組CMECs上清液細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)條帶圖

脂多糖組與對(duì)照組比較，＊ P<0.01；與脂多糖組比較，# P<0.01。

3 討 論

CMD是冠心病的重要發(fā)病機(jī)制[8]。通過(guò)正電子發(fā)射斷層掃描檢測(cè)1 218例存在心絞痛病人的冠狀動(dòng)脈微血管灌注情況的研究顯示，約51%的男性和54%的女性都患有CMD[9]。有研究表明，心絞痛病人存在CMD會(huì)使不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[10]。因此，CMD的積極防治對(duì)心血管疾病的預(yù)防具有重要意義。CMD是由多種因素相互作用而造成的冠狀動(dòng)脈微血管結(jié)構(gòu)或功能異常[11]，其結(jié)構(gòu)異常包括微血管內(nèi)皮腫脹、破裂或微血管直徑或密度改變等[12-13]，功能異常則以內(nèi)皮功能障礙最為常見(jiàn)[14]，主要表現(xiàn)為血管舒張因子與收縮因子分泌不平衡，導(dǎo)致微血管痙攣、血流量減少、心肌灌注水平降低[15-16]。eNOS是血管壁中NO的主要來(lái)源，具有調(diào)節(jié)微血管舒張功能的作用，保護(hù)血管內(nèi)皮的完整性[17]。研究顯示，與大動(dòng)脈比較，小動(dòng)脈eNOS蛋白含量明顯增加[18]，eNOS水平對(duì)維持冠狀動(dòng)脈微血管正常功能具有重要作用。

CMD在中醫(yī)學(xué)中屬“胸痹”范疇，心絡(luò)氣血生成不足或氣血運(yùn)行不暢，心失濡養(yǎng)，痰瘀內(nèi)阻，血脈不通，發(fā)為胸痹。本病多為本虛標(biāo)實(shí)之證，故治療以益氣活血為主。如顏德馨教授經(jīng)驗(yàn)方益心湯以黃芪、黨參益氣養(yǎng)心為君，輔以葛根、川芍、丹參、赤芍、降香等以活血通脈[19]。吳以嶺教授的通心絡(luò)膠囊以人參為君補(bǔ)益氣血，而又以水蛭、赤芍等藥物化瘀通絡(luò)，仍以“益氣活血通絡(luò)”為治療核心[20]。因此，益氣、活血并進(jìn)，標(biāo)本兼顧是CMD中醫(yī)治療的重要原則。

天香丹由紅景天、丹參等中藥組成，補(bǔ)心肝之血，肺、脾、腎精元之氣，開(kāi)泄水飲痰濁瘀血。研究表明，天香丹可保護(hù)血管內(nèi)皮功能、抑制炎癥反應(yīng)、減少血栓形成[21-22]。本研究結(jié)果顯示，天香丹可減輕微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，減少微血栓，增加心肌MVD，還可通過(guò)增加eNOS的蛋白表達(dá)及NO的分泌，改善CMD大鼠的內(nèi)皮功能。

綜上所述，本研究從動(dòng)物及細(xì)胞水平證明了天香丹對(duì)心肌微血管結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮功能的保護(hù)作用，為天香丹防治CMD提供了客觀依據(jù)。在后續(xù)研究中還需從天香丹改善內(nèi)皮功能障礙的內(nèi)在機(jī)制角度進(jìn)行進(jìn)一步深入探討。