基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討清熱活血方對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制

紀(jì)樹亮，李 睿，孫治中，林莉雯，紀(jì)曉棟，吳 偉

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指心肌梗死(myocardial infarction，MI)病人行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)等再灌注治療后，心肌損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。MIRI往往與炎癥反應(yīng)、鈣超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、凋亡等有關(guān)[1-2]，但具體機(jī)制尚未明確。MIRI可引發(fā)惡性心律失常、心力衰竭等嚴(yán)重不良后果。因此，積極預(yù)防和緩解PCI術(shù)后并發(fā)的MIRI是提高心肌缺血救治效率及急性心肌梗死病人遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)鍵。近年來，中醫(yī)藥在治療疾病方面已表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。清熱活血湯具有清熱解毒活血的功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，清熱活血方可有效減少PCI術(shù)后病人MIRI發(fā)生及發(fā)揮保護(hù)心肌的作用[3]，但其潛在治療機(jī)制尚不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接預(yù)測清熱活血方對MIRI的保護(hù)作用機(jī)制，以期為后期實(shí)驗(yàn)研究提供理論支撐與參考。

1 資料與方法

1.1 清熱活血方活性成分的搜集及靶點(diǎn)預(yù)測 使用“Dan Shen”“Chi Shao”“Chuan Xiong”“Hong Hua”“Jiang Xiang”“Mao Dong Qing”“Haung Qin”作為清熱活血方中7味中藥的檢索式，在BAT-MAN(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)網(wǎng)站的重要數(shù)據(jù)庫中檢索每一味中藥對應(yīng)的活性成分。使用BAT-MAN網(wǎng)站內(nèi)置的分子匹配系統(tǒng)進(jìn)行活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測，根據(jù)匹配分值選取得分>20分的靶點(diǎn)作為預(yù)測靶點(diǎn)。

1.2 搜集MIRI靶點(diǎn)并與清熱活血方靶點(diǎn)取交集 使用“myocardial ischemia reperfusion injury”作為MIRI的檢索式，在GeneCards(https：//www.genecards.org/)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫中檢索獲取與MIRI相關(guān)靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與清熱活血方的預(yù)測靶點(diǎn)取交集，獲取的靶點(diǎn)即為清熱活血方治療MIRI的相關(guān)靶點(diǎn)。結(jié)果使用Omicshare(http：//www.omicshare.com/tools/)云平臺制作韋恩圖。

1.3 構(gòu)建清熱活血方治療MIRI的“成分-靶點(diǎn)”圖 依據(jù)清熱活血方治療MIRI的相關(guān)靶點(diǎn)，找出對應(yīng)的活性成分，使用Cytoscape 3.5.3構(gòu)建清熱活血方治療MIRI的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并使用網(wǎng)絡(luò)分析模塊對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，按照連接度(degree)的大小對圖像由大到小排列，得到“成分-靶點(diǎn)”圖。

1.4 構(gòu)建“蛋白-蛋白”相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)并提取核心靶點(diǎn) 將清熱活血方治療MIRI的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https：//string-db.org)數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為人，對靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到靶點(diǎn)的“蛋白-蛋白”作用關(guān)系圖。并將對應(yīng)關(guān)系保存，導(dǎo)入Cytoscape 3.5.3軟件構(gòu)建靶點(diǎn)之間的PPI圖，使用內(nèi)置的網(wǎng)絡(luò)分析模塊進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，選取degree值大于二倍中位數(shù)的靶點(diǎn)，作為清熱活血方治療MIRI的核心靶點(diǎn)。

1.5 富集分析 將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，通過功能分析模塊進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析。GO分析包括3個(gè)類別：細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)，3組中選取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的通路，并且排除細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)代謝相關(guān)通路，整理后通過Omicshare云平臺的GO富集分析模塊可視化。KEGG結(jié)果選擇具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的通路，排除寄生蟲及癌癥等不相關(guān)通路，通過Omicshare云平臺的富集分析高級氣泡功能構(gòu)建KEGG分析的高級氣泡圖。

1.6 分子對接 選取核心靶點(diǎn)以及活性成分中degree值較為靠前的部分靶點(diǎn)及活性成分進(jìn)行分子對接。在PDB(https：//www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫中找出靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)，使用Auto Dock Vina軟件將靶點(diǎn)蛋白和活性成分進(jìn)行分子對接，認(rèn)為結(jié)合能<-20.9 kJ/mol，提示結(jié)合有意義，即活性成分與核心靶點(diǎn)間的作用關(guān)系具有一定的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 清熱活血方各藥物活性成分及藥物作用靶點(diǎn) 通過檢索篩選及匹配后，獲得各藥物活性成分及藥物作用靶點(diǎn)分別為：丹參活性成分38個(gè)、藥物作用靶點(diǎn)1 806個(gè)，紅花活性成分20個(gè)、靶點(diǎn)771個(gè)，赤芍活性成分3個(gè)、藥物作用靶點(diǎn)42個(gè)，川芎活性成分70個(gè)、藥物作用靶點(diǎn)4 268個(gè)，降香活性成分3個(gè)、藥物作用靶點(diǎn)24個(gè)，毛冬青活性成分2個(gè)、藥物作用靶點(diǎn)12個(gè)，黃芩活性成分13個(gè)、藥物作用靶點(diǎn)652個(gè)，將各藥物活性成分及藥物作用靶點(diǎn)合并查重后，共獲得藥物活性成分149個(gè)，藥物作用靶點(diǎn)1 241個(gè)。

2.2 MIRI疾病相關(guān)靶點(diǎn)和“清熱活血方-MIRI”共同作用靶點(diǎn)預(yù)測 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，共獲得MIRI相關(guān)靶點(diǎn)1 753個(gè)，與清熱活血方藥物作用靶點(diǎn)取交集，得到“藥物-疾病”共同作用靶點(diǎn)223個(gè)。詳見圖1。

圖1 清熱活血方-MIRI共同作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 清熱活血方治療MIRI的“藥物活性成分-共同作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 通過“清熱活血方-MIRI”共同作用靶點(diǎn)能夠反向推出相對應(yīng)的藥物活性成分，223個(gè)共同作用靶點(diǎn)分別對應(yīng)114個(gè)藥物活性成分，并將二者的對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscpe 3.5.3軟件中，將“藥物活性成分-共同作用靶點(diǎn)”可視化，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，并使用內(nèi)置的網(wǎng)絡(luò)分析功能對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，依據(jù)degree值，調(diào)節(jié)點(diǎn)的大小、位置，degree值越大，點(diǎn)越大，說明這個(gè)藥物活性成分或者靶點(diǎn)在清熱活血方治療MIRI方面具有更重要的潛在作用，但還應(yīng)結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行判斷和討論。由網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)可知，主要的藥物活性成分包括隱丹參酮、棕櫚酸、大黃酚等。degree值前20位的活性成分詳見表1。

圖2 清熱活血方治療MIRI的“藥物活性成分-共同作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 degree值前20的活性成分

2.4 PPI關(guān)系及核心靶點(diǎn)篩選 將223個(gè)共同作用靶點(diǎn)全部導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到“蛋白-蛋白”相互作用關(guān)系。再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.5.3進(jìn)行可視化，并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，設(shè)定大于Degree值的2倍中位數(shù)作為核心靶點(diǎn)篩選條件，共獲得核心靶點(diǎn)77個(gè)。各核心靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系詳見圖3。

圖3 核心靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系圖

2.5 核心靶點(diǎn)的GO富集分析 對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，共獲得332個(gè)條目，其中BP 130條、CC 73條、MF 129條。依據(jù)富集基因數(shù)目進(jìn)行排序，選取前20條目進(jìn)行展示，并排除細(xì)胞內(nèi)無特異性代謝相關(guān)通路，其中BP有7條，主要涉及細(xì)胞的增殖與凋亡、相關(guān)細(xì)胞因子的分泌調(diào)控以及鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)等；CC有7條，主要涉及膜筏、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位；MF有6條，主要包括受體配體結(jié)合以及細(xì)胞因子活性等。詳見圖4、表2。

表2 GO富集結(jié)果

圖4 GO富集圈圖

2.6 核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 對核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，根據(jù)富集基因數(shù)目進(jìn)行排序，篩選獲得9條通路，主要涉及腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、核因子-κB(NF-κB)信號通路、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路等。詳見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接 根據(jù)核心靶點(diǎn)及通路富集分析結(jié)果，清熱活血方治療MIRI主要涉及炎癥、自噬與凋亡等方面。TNF、白細(xì)胞介素(IL)-6是促炎性因子，TP53與凋亡相關(guān)，均在MIRI病理過程中有重要的調(diào)控作用[4]；胰島素樣生長因子1(IGF-1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)介導(dǎo)的自噬參與了心臟疾病的發(fā)展過程，能夠調(diào)控缺血心肌的自噬水平[5]。故選取上述靶點(diǎn)與degree值前10的藥物活性成分進(jìn)行分子對接，驗(yàn)證二者的結(jié)合能力(見圖6)。分析結(jié)果可知，除caffeic acid dimethyl ether、linoleic acid、myrcene外，其余藥物活性成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均<-20.9 kJ/mol，說明結(jié)合情況良好(見圖7)。

圖6 分子對接結(jié)合能熱圖

圖7 結(jié)合能最低的兩個(gè)分子對接圖

3 討 論

一般認(rèn)為，MIRI的病機(jī)多為血瘀[6]。陳可冀院士在血瘀病機(jī)基礎(chǔ)上提出“瘀毒致變”學(xué)說[7]。吳偉教授結(jié)合嶺南地區(qū)氣候濕熱、土卑地薄，人們嗜食肥甘厚味或精神壓力大、勞神耗氣，傷及心脾、滋生火熱，進(jìn)而提出熱毒血瘀乃胸痹心痛(冠心病)病人重要病機(jī)，并創(chuàng)立了清熱活血方[3]。清熱活血方由毛冬青、黃芩、川芎、赤芍、降香、紅花和丹參組成。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，清熱活血方能有效提高急性ST段抬高型心肌梗死PCI術(shù)后病人的臨床療效及降低病人死亡率[8]。有研究指出，與單用活血中藥治療相比，將活血化瘀中藥與清熱解毒中藥結(jié)合組方進(jìn)行治療可進(jìn)一步提高臨床療效[9]。有關(guān)藥理學(xué)研究表明，活血化瘀方藥，如冠心Ⅱ號方[10]，可改善心臟微循環(huán)。清熱解毒中藥具有抗炎、降低血脂等作用[11-12]。在活血化瘀基礎(chǔ)上，聯(lián)合清熱解毒中藥，可進(jìn)一步降低血脂水平，減少炎性細(xì)胞浸潤及斑塊形成，有效防治動(dòng)脈粥樣硬化[13-14]。然而，目前清熱活血方治療MIRI的潛在藥理機(jī)制的報(bào)道較少，清熱聯(lián)合活血中藥的藥理效應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)對清熱活血方的治療機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測，結(jié)果顯示，清熱活血方主要的活性成分包括隱丹參酮、棕櫚酸、大黃酚等。研究顯示，隱丹參酮能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的黏附因子表達(dá)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善MIRI[15]。通過降低棕櫚酸濃度，有助于MIRI后大鼠心功能的恢復(fù)[16]。大黃酚能夠降低小鼠腦缺血再灌注后多器官的氧化應(yīng)激水平，抑制心臟等多個(gè)臟器的細(xì)胞凋亡[17]。此外，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，黃芩有效成分黃芩苷可通過抗炎、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用改善MIRI[18]；毛冬青皂苷E可減輕心肌氧化應(yīng)激水平，抑制細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[19]?；谝陨涎芯?，推測清熱活血方主要是通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡等作用發(fā)揮保護(hù)MIRI的作用。

分析并結(jié)合目前相關(guān)研究得到主要靶點(diǎn)為：IL-6、TNF、TP53、HIF-1α、IGF-1等。通路富集分析推測，清熱活血方可能涉及參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，通過調(diào)控TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等發(fā)揮治療作用。TNF信號通路可通過不同途徑來激活體內(nèi)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。有實(shí)驗(yàn)研究指出，通過減少IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌，能夠減小心肌梗死面積、改善MIRI[20-21]。通過使用TP53抑制劑負(fù)調(diào)控TP53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，減少M(fèi)IRI風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，提高心臟功能[22]。PI3K/Akt是調(diào)控細(xì)胞自噬的主要信號通路之一，心肌細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧的早期階段PI3K/Akt信號通路被激活，進(jìn)而抑制其下游雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性，促進(jìn)自噬，降解細(xì)胞內(nèi)多余蛋白質(zhì)及衰老的細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞[23]。當(dāng)缺血發(fā)生時(shí)，HIF-1α水平在胞內(nèi)迅速升高，從而誘導(dǎo)自噬，改善心肌損傷[5]。此外，IGF-1也能夠通過促進(jìn)自噬，減輕大鼠心肌細(xì)胞凋亡[24]。MAPK信號通路同樣參與了MIRI的調(diào)節(jié)，主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun-氨基端激酶1/2(JNK1/2)和p38 MAPKα/β 3條并行信號通路。有研究發(fā)現(xiàn)通過抑制p38 MAPK磷酸化，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)以及下調(diào)促凋亡基因BAX等的活性，可減少心肌細(xì)胞凋亡，提高再灌注時(shí)心臟功能[25]。提示清熱活血方可能通過調(diào)控自噬、抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善MIRI。此外，本研究分子對接結(jié)果提示清熱活血方部分活性成分與MIRI疾病相關(guān)靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，一定程度上印證了本研究預(yù)測的清熱活血方活性成分與MIRI疾病相關(guān)靶點(diǎn)間的作用關(guān)系。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接角度，預(yù)測并探討了清熱活血方治療MIRI的潛在分子作用機(jī)制，揭示了清熱活血方具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的綜合作用特點(diǎn)。清熱活血方治療MIRI機(jī)制可能涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、自噬等多種途徑，可為后續(xù)進(jìn)一步的機(jī)制研究提供方向，但是各作用途徑間是否存在相互調(diào)控的作用關(guān)系，仍有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。