循環(huán)腫瘤DNA檢測在胃癌診療中的應(yīng)用現(xiàn)狀

王 芮， 李朝燕， 趙愛光

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

胃癌的發(fā)病率居常見惡性腫瘤的第4位，近年來呈逐年上升的趨勢[1]，已成為世界范圍內(nèi)因腫瘤致死的第2大疾病[2]。我國是胃癌的高發(fā)地區(qū)[3]，但由于胃鏡檢查的有創(chuàng)性及早期篩查的不普及，我國早期胃癌檢出率僅為10%[4]，約有40%的患者在被確診時已處于晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）125、CA19-9、CA72-4等血液腫瘤標(biāo)志物診斷胃癌的敏感性和特異性均不高，臨床應(yīng)用受限。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）由壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放到血液中，或由腫瘤細(xì)胞直接分泌，也可由外泌體釋放。ctDNA攜帶與腫瘤相關(guān)的遺傳信息，在胃癌的早期診斷、疾病進(jìn)展和耐藥監(jiān)測、腫瘤復(fù)發(fā)和微小病灶評估方面具有指導(dǎo)意義。為此，本文對ctDNA的生物學(xué)特征和檢測方法，及其在胃癌中的臨床價值進(jìn)行綜述。

1 ctDNA的生物學(xué)特征和檢測方法

1.1 生物學(xué)特征

c t D N A是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外游離DNA，由單鏈DNA、雙鏈DNA或單雙鏈混合DNA構(gòu)成，存在于血液、腦脊液等體液中，是腫瘤細(xì)胞、原發(fā)腫瘤組織、轉(zhuǎn)移灶通過壞死、凋亡或直接分泌的方式被釋放到外周血中的循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA），ctDNA是cfDNA中攜帶腫瘤特有突變的小部分DNA，這些游離的片段攜帶腫瘤信息[5]。ctDNA存在于腫瘤患者的血液中，其檢出率與腫瘤分期和體積成正比，而cfDNA的升高還可見于良性病變、炎癥性疾病或創(chuàng)傷等情況。有研究結(jié)果顯示，ctDNA片段的大小、結(jié)構(gòu)有差異，因細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA片段多為70～200 bp，而細(xì)胞壞死產(chǎn)生的DNA片段較長，為200～21 000 bp。ctDNA在血液中可被快速清除，半衰期通常為15 min～2 h，因此可進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測[6]。血液中的ctDNA主要通過循環(huán)酶、腎臟排泄，被肝和脾吸收后，經(jīng)巨噬細(xì)胞降解等途徑降解。ctDNA與蛋白復(fù)合物、胞外囊泡和血清蛋白的結(jié)合可能會影響其清除率，不同細(xì)胞攝取ctDNA的速率也可能會影響其清除率[7-8]。ctDNA攜帶腫瘤特異性基因特征和表觀遺傳學(xué)特征，如基因的突變、插入、缺失，染色體重排，拷貝數(shù)變異和甲基化改變等，因此ctDNA有成為腫瘤生物標(biāo)志物的潛力。

1.2 檢測方法

ctDNA僅占cfDNA的0.01%，含量極低，因此需要高敏感的檢測方法。目前常用的檢測方法為二代測序（next generation sequencing，NGS）和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。NGS采用邊合成邊測序的方法實(shí)現(xiàn)對未知基因及突變的篩查，特點(diǎn)為高通量、高精度和高特異性，可在多個基因中檢測到多個位點(diǎn)的突變，提供更加全面的基因組學(xué)信息，進(jìn)一步提高了ctDNA的檢測效率。ZHOU等[9]采用NGS檢測結(jié)直腸癌患者ctDNA的單核苷酸變異數(shù)（single-nucleotide variation，SNV），證實(shí)該法可反映腫瘤異質(zhì)性、評估術(shù)后腫瘤負(fù)荷，可用于追蹤原發(fā)和轉(zhuǎn)移性病灶。用于ctDNA檢測的常用PCR方法為數(shù)字PCR。該法可對已知的靶基因及突變進(jìn)行定量檢測，測序精度較高，其衍生出的微滴式數(shù)字PCR可精確計(jì)算出靶分子的拷貝數(shù)和濃度[10]。目前，已有許多基于微滴式數(shù)字PCR的商品化檢測系統(tǒng)，如Raindrop digital PCR（美國RainDance Technologies公司）、QX200 Droplet Digital System（美國伯樂公司）和Naica System（法國Stilla Technologies公司）[11]。此外，BEAMing技術(shù)也是較常用的PCR技術(shù)，其將數(shù)字化PCR與流式技術(shù)相結(jié)合，利用磁珠與微乳滴結(jié)合的原理，對ctDNA進(jìn)行絕對定量檢測。另外，由于血液中的ctDNA半衰期較短（15 min～2 h），需要快速處理，因此檢測樣本首選血漿，以避免基因組DNA的 污染[12-13]。

2 ctDNA在胃癌診斷中的應(yīng)用

多數(shù)胃原位癌經(jīng)根治性手術(shù)后可被治愈，但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，即使有手術(shù)指征，預(yù)后也普遍較差。因此，腫瘤研究的重要目標(biāo)之一是盡早識別腫瘤，以實(shí)施治療。ctDNA作為血液學(xué)指標(biāo)，可在胃癌診斷方面發(fā)揮一定的作用。

COHEN等[14]研發(fā)出一個名為CancerSEEK的檢測方法，即將ctDNA與血液中的蛋白指標(biāo)結(jié)合起來，以實(shí)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)移前診斷，并定位原發(fā)灶，提高根治性手術(shù)的治愈率；結(jié)果顯示，CancerSEEK對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期腫瘤診斷的中位敏感性分別是43%、73%、78%，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線提示在62%的受試者中，該方法的特異性＞99%，該法可增加診斷敏感性，同時不會降低特異性。LI等[15]采用ctDNA測序篩選出胃癌的高頻突變基因KMT2D，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因可能是一種促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的癌基因，可初步用于胃癌的診斷。有Meta分析結(jié)果顯示，ctDNA診斷胃癌的合并敏感性[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]和合并特異性（95%CI）分別為62%（59%～65%）、95%（93%～96%），因此特定ctDNA基因突變類型與胃癌瘤體增大及疾病進(jìn)展等不良事件的發(fā)生有關(guān)[16]。

表觀遺傳學(xué)改變常發(fā)生在腫瘤初期，甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，因此可通過ctDNA甲基化檢測進(jìn)行腫瘤診斷。LING等[17]的研究結(jié)果顯示，ctDNA XAF1甲基化與胃癌密切相關(guān)，或可用于胃癌的診斷。有學(xué)者對液體活檢技術(shù)在胃癌應(yīng)用方面的文獻(xiàn)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)有大量證據(jù)支持ctDNA可作為胃癌初步診斷的生物標(biāo)志物，其診斷價值優(yōu)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）[18]。ctDNA用于早期腫瘤診斷的挑戰(zhàn)之一是其檢測的敏感性，因?yàn)闊o癥狀個體的ctDNA水平通常較低，因此需要使用大量的血液樣本，或使用高敏感的檢測方法，如微滴式數(shù)字PCR和NGS[19]。目前，ctDNA在胃癌診斷方面的研究仍處于探索階段，需要更多的研究證實(shí)其有效性。另外，相關(guān)檢測技術(shù)也有待進(jìn)一步改進(jìn)。

3 ctDNA在胃癌患者靶向治療、療效監(jiān)測、耐藥機(jī)制中的作用

胃癌存在很大的異質(zhì)性，提取的部分組織樣本不能反映整個腫瘤的病理組織和基因信息，且原發(fā)腫瘤的基因概況與轉(zhuǎn)移灶有可能不一致。在腫瘤治療的不同階段，需要反復(fù)檢測相關(guān)基因，以了解耐藥的分子因素和可適用的新治療靶點(diǎn)。ctDNA檢測有助于胃癌的縱向監(jiān)測和分析，以實(shí)現(xiàn)個體化治療方案的定制和管理。

3.1 ctDNA在胃癌患者靶向治療篩選和療效監(jiān)測中的作用

人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）是一種跨膜的絡(luò)氨酸激酶受體，有6%～23%的胃癌患者過表達(dá)HER-2，曲妥珠單抗治療HER-2陽性胃癌患者的有效性已被證實(shí)[20]。篩查HER-2水平的傳統(tǒng)方法是采用病理學(xué)方法對獲取的胃癌組織樣本進(jìn)行檢測。但由于胃癌本身的異質(zhì)性及取材部位的差異，無法確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，可能會漏掉部分存在曲妥珠單抗治療指征的患者。ctDNA能克服腫瘤異質(zhì)性的影響，對腫瘤異質(zhì)性狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測和評估。SHODA等[21]使用微滴式數(shù)字PCR檢測胃癌患者ctDNA中HER-2拷貝數(shù)的變化，以RPPH1為參考基因，將RPPH1與HER-2的比值稱為HER-2率，結(jié)果顯示，隨著胃癌的進(jìn)展或復(fù)發(fā)，HER-2率持續(xù)升高，ctDNA可篩選出HER-2陰性但在復(fù)發(fā)后逆轉(zhuǎn)的胃癌患者。WANG等[22]收集了78例胃癌患者的組織樣本和配對的血液樣本，檢測了HER-2的拷貝數(shù)和突變數(shù)，結(jié)果顯示，血液樣本與組織樣本具有較高的一致性 （P=0.000 39），ctDNA可用于檢測血液中HER-2基因的SNV和拷貝數(shù)。PECTASIDES等[23]的研究結(jié)果顯示，原發(fā)性胃食管腫瘤組織與轉(zhuǎn)移灶配對樣本中的基因突變差異很大，他們進(jìn)一步對基因測序結(jié)果存在差異的患者進(jìn)行ctDNA檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶中的靶基因突變與ctDNA的一致率達(dá)87.5%，因此建議將ctDNA測序作為選擇分子靶向藥物治療的標(biāo)志物。由此可見，采用ctDNA對胃癌患者進(jìn)行靶向治療的篩選是可行的，臨床可根據(jù)每個胃癌患者的不同情況，在治療進(jìn)程中使用ctDNA評估患者不同時間段的基因變異水平，以不斷完善治療方案。

LIU等[24]的研究結(jié)果顯示，利用組織樣本測序與采用血液樣本進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR檢測得到的HER-2擴(kuò)增一致率為81.4%；他們對12例行FOLFOX+曲妥珠單抗治療的胃癌術(shù)后患者隨訪1年，每2個月檢測1次HER-2拷貝數(shù)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過2個月的治療后，HER-2率顯著降低（P＜0.000 1），而當(dāng)胃癌發(fā)生進(jìn)展時，HER-2率較未進(jìn)展時增高2.3～4.1倍，12例胃癌患者的中位無進(jìn)展生存時間（progressionfree survival，PFS）為9.8個月。由此可見，采用微滴式數(shù)字PCR檢測胃癌患者不同臨床進(jìn)程中的血漿HER-2率，可反映疾病進(jìn)展和治療效果。AGUILAR-MAHECHA等[25]通過監(jiān)測1例HER-2陽性胃癌患者ctDNA水平的HER-2拷貝數(shù)和PIK3CA突變，發(fā)現(xiàn)HER-2拷貝數(shù)與藥物反應(yīng)和疾病進(jìn)展的聯(lián)系優(yōu)于CEA，建議將ctDNA檢測作為監(jiān)測HER-2陽性患者治療反應(yīng)的方法之一。還有學(xué)者研究了ctDNA在預(yù)測胃癌患者對免疫治療不良反應(yīng)中的作用，結(jié)果顯示，接受免疫治療后血漿ctDNA陽性患者的中位PFS為7.4個月，顯著長于血漿ctDNA陰性的患者（4.9個月）（P=0.025）；從ctDNA中發(fā)現(xiàn)CEBPA、FGFR4、MET、KMT2D基因突變的患者發(fā)生免疫相關(guān)不良反應(yīng)的可能性更大（P=0.09），因此ctDNA可用來監(jiān)測免疫治療的效果[26]。雖然有較多研究證實(shí)ctDNA可用于指導(dǎo)治療和療效監(jiān)測，但仍需要大樣本量研究來證實(shí)其有效性。

3.2 ctDNA在闡述耐藥機(jī)制中的作用

液體活檢可被用來分析由原發(fā)腫瘤異質(zhì)性引起的曲妥珠耐藥，并解釋因新的分子突變而導(dǎo)致的耐藥。WANG等[27]通過檢測胃癌患者ctDNA，發(fā)現(xiàn)了32個與曲妥珠耐藥相關(guān)的突變基因，并提出可用于預(yù)測疾病進(jìn)展的腫瘤分子負(fù)荷指數(shù)（molecular tumor burden index，mTBI）；他們將mTBI分為3個不同的級別，由低到高依次為相關(guān)的基因突變、激活的基因或通路、突變基因出現(xiàn)擴(kuò)增；揭示了胃癌患者對曲妥珠單抗的耐藥機(jī)制，其中EGFR、MET的SNV與曲妥珠單抗耐藥密切相關(guān)。SHAHJEHAN等[28]采用ctDNA基因型檢測來監(jiān)測HER-2陽性胃癌患者對曲妥珠單抗的耐藥性，結(jié)果顯示，有76.5%的患者存在多種耐藥機(jī)制，這些患者在接受曲妥珠單抗治療時PFS較短。DU等[29]采用NGS對胃癌患者的ctDNA進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，存在MET擴(kuò)增的胃癌患者對克唑替尼的耐藥機(jī)制包括MET擴(kuò)增和MET的多重二次突變，這也是患者病情惡化的原因。ZHANG等[30]的研究結(jié)果表明，基于ctDNA檢測得到的ERBB2特定位點(diǎn)突變（V659D和L7555S）可能會導(dǎo)致胃癌患者對派洛替尼獲得性耐藥，但該結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。腫瘤患者病情的快速進(jìn)展可能是由于獲得性耐藥突變和預(yù)先存在的腫瘤分子異質(zhì)性導(dǎo)致的。腫瘤患者對抗腫瘤藥物的耐藥機(jī)制是復(fù)雜且多樣的，因此全面分析分子特征對于腫瘤患者治療策略的制定極為重要。ctDNA檢測有助于闡明腫瘤患者對抗腫瘤藥物的耐藥機(jī)制。

4 ctDNA對胃癌根治術(shù)預(yù)后的評估

在經(jīng)根治術(shù)治療后，仍有20%～50%的胃癌患者可能會發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移，因此尋找一個有效的預(yù)測因子來識別復(fù)發(fā)高危人群非常重要。ctDNA可用于追蹤胃癌根治術(shù)后微小殘余病灶，預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。有研究結(jié)果顯示，基線ctDNA水平及ctDNA中基因突變數(shù)的增加與胃癌進(jìn)展期患者不良預(yù)后和多位點(diǎn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，ctDNA或可用于評估胃癌患者的治療反應(yīng)[22]。KIM等[31]通過動態(tài)監(jiān)測19例胃癌根治術(shù)患者術(shù)后12個月內(nèi)的血液ctDNA水平，發(fā)現(xiàn)術(shù)后12個月內(nèi)ctDNA陽性與胃癌復(fù)發(fā)相關(guān)（P=0.029），且預(yù)示胃癌復(fù)發(fā)的中位時間較臨床復(fù)發(fā)縮短了4.5個月，術(shù)前ctDNA陽性與胃癌復(fù)發(fā)無關(guān)。有Meta分析結(jié)果顯示，ctDNA與胃癌患者較短的總生存期和PFS密切相關(guān)，提示出現(xiàn)一定量的ctDNA預(yù)示著預(yù)后不良[16]。LI等[32]的研究結(jié)果表明，通過ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)TP53突變和MET基因擴(kuò)增可用于預(yù)測胃癌進(jìn)展期患者的不良預(yù)后。

5 ctDNA檢測的不足和應(yīng)用展望

雖然有較多研究證實(shí)ctDNA可在胃癌的早期篩查和診斷、靶向藥物選擇、療效和復(fù)發(fā)監(jiān)測、預(yù)后評估等方面發(fā)揮作用，但ctDNA檢測的局限性仍不容忽視：（1）ctDNA檢測目前主要依賴于深度NGS，成本較高；（2）ctDNA在外周血中的豐度較低，不同檢測平臺的敏感性和特異性存在較大差異，缺乏統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室之間檢測結(jié)果的可比性較差，結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和再現(xiàn)性是不可忽視的問題，需要專門的技術(shù)支持；（3）目前尚無臨界值來區(qū)分高濃度和低濃度，血液樣本保存不當(dāng)容易導(dǎo)致ctDNA降解，因此需要建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程；從預(yù)分析階段開始，各處理步驟，包括血漿體積、儲存溫度、采血至血漿分離的時間間隔、離心方案和純化方法都有可能影響最終的檢測結(jié)果[33]。

液體活檢是未來腫瘤研究的重要領(lǐng)域之一，但仍缺乏前瞻性、大樣本量的研究，且腫瘤不同分型之間存在固有的異質(zhì)性。目前有關(guān)胃癌的研究仍較少，這可能與胃癌發(fā)生、發(fā)展中復(fù)雜的多階段、多因素過程，較大的瘤內(nèi)異質(zhì)性，涉及大量腫瘤相關(guān)基因結(jié)構(gòu)改變與表達(dá)異常有關(guān)。本研究總結(jié)了胃癌中基于ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)的有價值的分子標(biāo)志物及其作用[13，34-36]，具體結(jié)果見表1。通過ctDNA識別腫瘤基因和表觀遺傳學(xué)的變化，并將其應(yīng)用到胃癌的診斷、治療、療效監(jiān)測及預(yù)后評估中，會使胃癌的個體化治療邁上一個新臺階。另外，除評估腫瘤組織樣本檢測與液體活檢的一致性外，還需要針對不同亞型的腫瘤單獨(dú)研究ctDNA的價值和可行性，以更好了解其優(yōu)勢與局限。

表1 ctDNA識別胃癌分子標(biāo)志物的相關(guān)研究概覽