N6-甲基腺苷的生物學(xué)功能及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

孔玉潔， 王 晨， 何 炳

（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230001）

表觀遺傳是指基因的核苷酸序列不變，基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，使表型發(fā)生改變的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象往往是可遺傳的。近幾年的研究熱點主要集中于細(xì)胞核內(nèi)組蛋白的修飾、核苷酸的化學(xué)修飾等方面。有研究結(jié)果顯示，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）與哺乳動物的某些病理和生理過程密切相關(guān)，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、胚胎發(fā)育等[1]。本文綜述了m6A的分子機(jī)制、生物學(xué)功能以及檢測方法。

1 m6A甲基化

m6A修飾是一種發(fā)生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾。20世紀(jì)70年代，學(xué)者們第1次觀察到m6A甲基化修飾。2011年，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)m6A修飾是動態(tài)可逆的過程后，RNA表觀組學(xué)的研究步入了新的階段。目前已知的RNA轉(zhuǎn)錄后修飾有171種，m6A是大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中最常見的一種RNA修飾方式。宏觀上，m6A在哺乳動物中的表達(dá)具有特異性和偏好性；微觀上，m6A修飾主要發(fā)生在RRACH（[G/A][G＞A]m6AC[U＞A＞C]）共有序列中，且大多數(shù)位于轉(zhuǎn)錄起始位點、外顯子、終止密碼子、5'-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）、3'-UTR、核糖體相關(guān)mRNA和非編碼單鏈RNA等 區(qū)域[2]。

2 m6A相關(guān)調(diào)控蛋白

2.1 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（編碼器）

m6A由至少7個組分構(gòu)成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化形成，其中甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase like，METTL）3和METTL14是其核心成分，兩者均可在體內(nèi)和體外催化m6A的甲基化修飾過程。METTL3和METTL14通常以二聚體形式結(jié)合在一起，共同促進(jìn)m6A甲基化[3]。腎母細(xì)胞瘤1關(guān)聯(lián)蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP）本身沒有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但它能對特定的甲基化位點進(jìn)行精準(zhǔn)定位，其通過與METTL3/METTL14復(fù)合物相互作用，從而影響m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的活性[4]。

2.2 m6A去甲基酶（消碼器）

另一種參與m6A甲基化過程的蛋白復(fù)合物是m6A去甲基酶，其作用是作為“消碼器”，幫助實現(xiàn)RNA的去甲基化過程。1999年，PETERS等[5]在一種融合腳趾突變小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第1個去甲基化酶——肥胖基因相關(guān)蛋白（fatmass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO），該酶的發(fā)現(xiàn)表明m6A甲基化是動態(tài)的、可逆的。在FTO作用于m6A去甲基化時通常會產(chǎn)生2種中間產(chǎn)物：hm6A和f6A[6]。有研究結(jié)果顯示，甲氯芬那酸可抑制FTO的去甲基化作用[7]。

2013年，第2個m6A去甲基化酶——α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶同源物5（alk B homolog 5，ALKBH5）被發(fā)現(xiàn)[8]。大部分ALKBH5作用于單鏈RNA特定m6A位點，使其去甲基化[9]。ZHENG等[7]利用RNA原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)敲除ALKBH5基因能促進(jìn)mRNA出核，證實m6A可能參與了mRNA的出核轉(zhuǎn)運。動物實驗結(jié)果顯示，在小鼠模型中敲除ALKBH5基因，會出現(xiàn)mRNA中的m6A顯著升高、精子畸形和睪丸形狀異常等現(xiàn)象，表明m6A修飾對動物生殖發(fā)育有較大影響[7]。2017年，UEDA等[10]發(fā)現(xiàn)了第3種常見于tRNA的m6A去甲基酶——α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶同源物3（alk B homolog 3，ALKBH3），ALKBH3是一種公認(rèn)的DNA修復(fù)酶，并有可能作為腫瘤的分子標(biāo)志物。

2.3 m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶對RNA進(jìn)行甲基化修飾后，需要m6A甲基結(jié)合蛋白作為“讀碼器”發(fā)揮作用。m6A甲基結(jié)合蛋白的種類繁多，主要包括YTH結(jié)構(gòu)域家族、核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP）家族和真核起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）等[11]。YTH N6甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein，YTHDF）1可與mRNA終止密碼子附近的m6A位點結(jié)合，從而促進(jìn)RNA翻 譯[12]。而YTHDF2通過募集一種叫作CCR4-NOT的腺苷酸酶復(fù)合物，來促進(jìn)m6A修飾的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解[11]。YTHDF3能夠與YTHDF1結(jié)合，共同作用于甲基化mRNA的翻譯過程，同時還通過與YTHDF2的相互作用加速RNA降解[13]。YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（YTH domain-containing，YTHDC）1通過募集或限制不同的剪接因子來促進(jìn)外顯子剪接，還可與富含絲氨酸/精氨酸剪接因子3（serine and arginine rich splicing factor 3，SRSF3）和核RNA輸出因子1（nuclear RNA export factor 1，NXF1）相互作用，促進(jìn)m6A甲基化mRNA的核輸出[14]。YTHDC2可以通過在共有基序內(nèi)優(yōu)先結(jié)合m6A，從而促進(jìn)翻譯進(jìn)程，并減少目的mRNA的含量[15]。HNRNPA2B1通過與m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本結(jié)合來促進(jìn)miRNA的加工和成熟，HNRNPC和HNRNPG也能調(diào)節(jié)RNA的豐度和剪接[16]。此外，eIF3能夠與mRNA 5'-UTR中的某些m6A甲基化位點結(jié)合，提高mRNA的翻譯效率[17]。

3 m6A修飾的生物學(xué)影響

隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究結(jié)果表明，m6A修飾可在轉(zhuǎn)錄后水平多方面影響RNA的生物學(xué)功能，如翻譯、剪切、運輸、定位等，從而影響整個生物體的生長發(fā)育階段，如腦發(fā)育、免疫系統(tǒng)成熟等。

3.1 m6A對mRNA剪切及核輸出的影響

m6A在前體mRNA中的含量比在成熟mRNA中豐富，且往往集中分布于內(nèi)含子中[18]。如果敲除FTO，在前體RNA剪接過程中會出現(xiàn)外顯子跳躍現(xiàn)象，且3'末端的外顯子表達(dá)上調(diào)[20]。除此之外，METTL16可以甲基化RNA的3'-UTR，從而調(diào)控3'-UTR與mRNA 5'端剪切位點結(jié)合，并影響其剪切[20]。在METTL3缺失的情況下，核輸出往往會受到抑制[19]。

3.2 m6A對mRNA翻譯的調(diào)節(jié)作用

YTHDF1與YTHDF3可結(jié)合被m6A修飾的mRNA，并招募eIF3和eIF4A3，以提高CAP依賴翻譯的效率[21]。胰島素樣生長因子2可通過提高mRNA的穩(wěn)定性來促進(jìn)mRNA的翻譯[22]。METTL3可通過與核糖體結(jié)合，促進(jìn)翻譯起始復(fù)合物組裝，還可通過與eIF3h的結(jié)合，促進(jìn)mRNA翻譯環(huán)的形成、核糖體的循環(huán)利用和翻譯[23]。

3.3 m6A對mRNA降解的調(diào)節(jié)

RNA上的m6A修飾能夠影響mRNA的穩(wěn)定性，如YTHDF2可結(jié)合目標(biāo)mRNA上的m6A位點，從而促進(jìn)RNA降解[11]。

4 m6A修飾的生物學(xué)功能

越來越多的研究結(jié)果表明，m6A修飾參與了RNA生命功能的各個方面，進(jìn)而影響真核生物性別決定、T細(xì)胞免疫、生物節(jié)律、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)進(jìn)程。

4.1 m6A調(diào)控腦發(fā)育

m6A相關(guān)的調(diào)控蛋白在突觸功能、軸突再生、神經(jīng)干細(xì)胞自我更新，以及小腦發(fā)育中發(fā)揮著重要功能。動物實驗結(jié)果顯示，特異性敲除小鼠METTL14后，小鼠大腦皮層的發(fā)育會受到嚴(yán)重影響；而特異性敲除METTL3后，小鼠可能會出現(xiàn)嚴(yán)重的運動功能障礙，導(dǎo)致哺乳期死亡[24]。如果增加小鼠的學(xué)習(xí)訓(xùn)練量，小鼠前額葉中m6A水平也隨之增加，如果在乳鼠的皮層及海馬區(qū)條件性地敲除METTL3，會導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)能力明顯下降[25]，提示m6A修飾可能會影響小鼠記憶形成。此外，m6A也可被定位到樹突中，影響突觸的可塑性[26]。

4.2 m6A調(diào)控造血干細(xì)胞的定向分化

脊椎動物的造血干細(xì)胞是由生血內(nèi)皮細(xì)胞通過內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過程定向分化而來。m6A修飾可參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞的分化。在斑馬魚胚胎中，METTL3缺失會影響內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過程，使其不能發(fā)揮正常的生理作用；另外，m6A還可通過YTHDF2維持內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過程的平衡，進(jìn)而調(diào)控造血干細(xì)胞的定向分化[27]。

4.3 m6A與腫瘤

m6A修飾在不同類型的腫瘤中起著不同的作用。因此，了解調(diào)控m6A甲基化修飾的基因，探索m6A相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生過程中的影響和功能，對探索腫瘤發(fā)病機(jī)制和臨床治療有重要作用。目前已報道的m6A修飾相關(guān)蛋白表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系見 表1。

表1 m6A 修飾相關(guān)蛋白表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

4.3.1 m6A修飾抑制腫瘤進(jìn)展 在GBM中，解整合素樣金屬蛋白酶19（a disintegrin and metalloproteinase 19，ADAM19）的m6A修飾降低會增強(qiáng)其表達(dá)，促進(jìn)GBM干細(xì)胞的生長和自我更新，并最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在肝細(xì)胞肝癌中，m6A水平降低會破壞miR-126的腫瘤抑制功能，從而加速腫瘤的進(jìn)展。FTO介導(dǎo)的m6A甲基化下調(diào)會導(dǎo)致腫瘤抑制因子表達(dá)降低，從而導(dǎo)致白血病發(fā)生?？傊?，某些腫瘤的發(fā)展可能與RNA甲基化水平降低有關(guān)。

4.3.2 m6A修飾促進(jìn)腫瘤進(jìn)展 在AML中，m6A水平升高提高了mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)了AML的發(fā)生、發(fā)展。在肝癌中，細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）的m6A修飾增強(qiáng)可促進(jìn)其降解，從而加速腫瘤進(jìn)展。此外，在乳腺癌中，乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白（hepatitis B virus X interacting protein，HBXIP）的m6A甲基化上調(diào)會加速腫瘤發(fā)生。總之，RNA甲基化水平上調(diào)會導(dǎo)致腫瘤特異性癌基因表達(dá)和生物學(xué)功能的改變，從而促進(jìn)某些腫瘤發(fā)展。

5 m6A的檢測技術(shù)

mRNA中m6A甲基化修飾對核苷酸上的堿基配對無影響，因此用逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)難以檢測到m6A。薄層層析、斑點雜交和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法雖然能檢測到轉(zhuǎn)錄組中m6A的分布，但因其對物理和化學(xué)技術(shù)要求過高，很難檢測出整個轉(zhuǎn)錄組水平上的m6A分布。m6A檢測方法主要有10種：RNA甲基化測序（N6-methylated RNA sequencing，m6A-Seq）、RNA甲基化免疫共沉淀高通量測序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq）、二維薄層色譜（two-dimensional thin layer chromatography，2D-TLC）、斑點雜交、LC-MS/MS、位點特異性切割-放射性標(biāo)記-連接輔助提取-薄層色譜（site-specific cleavage and radioactive-labeling followed by ligation-assisted extraction and thin-layer chromatography，SCARLET）、光交聯(lián)輔助m6A測序（photo-crosslinking-assisted m6A sequencing，PA-m6A-Seq）、m6A單堿基分辨率紫外交聯(lián)沉淀結(jié)合高通量測序（m6A individual-nucleotideresolution cross-linking and immunoprecipitation combined with high-throughput sequencing，mi-CLIP-Seq）、m6A水平和異構(gòu)體鑒定測序（m6Alevel and isoform-characterization sequencing，m6ALAIC-Seq）、DpnI輔助N（6）-甲基腺嘌呤測序（DpnI-assisted N6-methyladenine sequencing，DAm6A-seq）。10種檢測方法的優(yōu)缺點見表2。

表2 10種m6A檢測方法的優(yōu)缺點

6 展望

除4種正常的核苷酸外，RNA還有大量被修飾過的核苷參與其組成。修飾核苷是表觀遺傳學(xué)的一種，是一種可遺傳、可逆的變化，且變化在遺傳基因組前發(fā)生，一般發(fā)生于腫瘤發(fā)展的早期階段。m6A過度修飾或修飾水平降低都可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。一般來說，未被修飾的核苷酸可以被反復(fù)利用，如被磷酸酯化后繼續(xù)參與合成新的核苷酸，或被降解產(chǎn)生β-丙氨酸和尿酸。而被修飾的核苷酸非常穩(wěn)定，不容易被代謝或被磷酸酯化再利用，而是被核酸酶酶解后經(jīng)尿液排出。因此，理論上檢測尿液或血液中的修飾核苷酸是早期診斷、監(jiān)測腫瘤的有效方法。有研究結(jié)果顯示，分別檢測隨機(jī)尿核苷酸和肌酐，用核苷酸/肌酐比值可以衡量尿中被修飾的核苷酸量[36-37]。

關(guān)于修飾核苷酸，目前大部分研究均集中于檢測癌組織細(xì)胞的m6A水平。目前，病理學(xué)是診斷腫瘤及其分期的重要標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)組織細(xì)胞處于病理學(xué)的臨界，難以確定或難以分期時，如能精確定量檢測人體血液、尿液等體液或排泄物中的m6A，并闡述其與腫瘤之間的關(guān)系，將有助于腫瘤的精確診斷。