環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)糞便樣本艱難擬梭菌的 臨床應(yīng)用

王詩淇， 李荷楠， 劉井波， 王占偉， 王知任， 遲大利， 王 輝

[1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044；2. 復(fù)星診斷科技（上海）有限公司參考檢測(cè)中心，上海 200444]

艱難擬梭菌是一種有芽孢、無莢膜、有鞭毛的革蘭陽性專性厭氧桿菌，廣泛存在于土壤、人類和其他動(dòng)物的腸道中。隨著高毒力和多重耐藥艱難擬梭菌的出現(xiàn)，醫(yī)院感染暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加。快速檢出艱難擬梭菌，將其從醫(yī)院環(huán)境中根除，同時(shí)隔離有癥狀的艱難擬梭菌感染患者是阻止艱難擬梭菌芽孢擴(kuò)散、有效預(yù)防醫(yī)院感染的重要措施。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）因操作方便、反應(yīng)時(shí)間短、無需額外購買特殊設(shè)備等優(yōu)勢(shì)，已被應(yīng)用于多種病原體感染的檢測(cè)中[1-3]。 本研究擬比較LAMP法與細(xì)菌培養(yǎng)法、艱難擬梭菌毒素法快速檢測(cè)糞便樣本中艱難擬梭菌的 差異。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2021年6—8月北京大學(xué)人民醫(yī)院住院患者臨床送檢剩余糞便樣本132例，其中54例血液科患者樣本。本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過（2019PHB063）。

1.2 方法

1.2.1 艱難擬梭菌毒素檢測(cè) 取200 μL液體糞便樣本或200 mg固體糞便樣本，加入1 000 μL樣本稀釋液（pH值7.2的Tris緩沖液、50%小牛血清、去污劑、防腐劑），用渦旋振蕩器徹底混勻，13 680×g離心5 min，分離上清液。取300 μL上清液，采用Mini VIDAS全自動(dòng)熒光酶標(biāo)免疫分析儀（法國生物梅里埃公司）及配套艱難擬梭菌毒素A/B檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）檢測(cè)。剩余樣本用于LAMP檢測(cè)。

1.2.2 艱難擬梭菌核酸提取 取蛋白酶K（北京索萊寶公司）20 μL，內(nèi)參反應(yīng)液[復(fù)興診斷科技（上海）有限公司] 5 μL，再加入300 μL制備好的糞便樣本稀釋上清液，采用TANBead E13200核酸提取儀（臺(tái)灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)開發(fā)有限公司）提取艱難擬梭菌核酸。嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書要求進(jìn)行操作。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 （1）艱難擬梭菌培養(yǎng)。將糞便樣本分別接種于環(huán)絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂（cycloserine-cefoxitin-fructose agar，CCFA）平板（英國OXOID公司）和血平板（美國ThermoFisher Scientific公司），放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋（法國生物梅里埃公司），置于5% CO2培養(yǎng)箱中，35 ℃培養(yǎng)48 h，采用Autoflex speed質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）鑒定可疑菌落。（2） 沙門菌和志賀菌培養(yǎng)。 將糞便樣本分別接種于SS平板、麥康凱平板（美國ThermoFisher Scientific公司），置于5% CO2培養(yǎng)箱中，35 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落；分離、純化可疑菌落后，采用VITEK 2 Compact自動(dòng)鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）進(jìn)行菌種鑒定；同時(shí)進(jìn)行多價(jià)血清凝集試驗(yàn)（沙門菌屬和志賀菌屬診斷血清購自寧波天潤公司）。

1.2.4 L A M P法的建立 通過L A M P引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer（http：//primerexplorer.jp/e/）設(shè)計(jì)引物，包括外引物F3（5'-GTGGGGAGCAAACAGGATT-3'）、B3（5'-TCTTCGCGTTGCTTCGAATT-3'），內(nèi)引物FIP（5'-CGTTAGCTGCGGCACCGAAGAGTCCACGCTGTAAACGATG-3'）、BIP（5'-CCTGGGAAGTACGCTCGCAAACATGCTCCGCTACTTGTG-3'），環(huán)引物L(fēng)F（5'-GGTAACCCCCGACACCTAGTAC-3'）、LB（5'-CTCAAAGGAATTGACGGGGAC-3'）。LAMP反應(yīng)體系為25 μL，包括14 μL艱難擬梭菌反應(yīng)液[復(fù)興診斷科技（上海）有限公司]、 1 μL Bst DNA聚合酶[復(fù)興診斷科技（上海）有限公司]、10 μL核酸提取液，反應(yīng)溫度為 63 ℃[4]；反應(yīng)時(shí)間為30 min。以無菌0.9%NaCl溶液為陰性對(duì)照，以循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）≤10.0為陽性。

1.2.5 LAMP法性能評(píng)價(jià) （1）特異性評(píng)價(jià)。 將糞便樣本分別接種于血平板、SS平板和麥康凱平板，5% CO2培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落，采用VITEK 2 Compac自動(dòng)化鑒定藥敏儀和Autoflex speed質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定，鑒定結(jié)果用于評(píng)價(jià)LAMP法的特異性。（2）靈敏度評(píng)價(jià)。①核酸提取。取3 mL經(jīng)高壓處理后的無菌0.9%NaCl溶液，將艱難擬梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 9689，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心）制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?，濃度相?dāng)于 108CFU/mL；取1 mL菌懸液，加入Eppendorf管中， 13 680×g離心5 min，棄上清液，加入300 μL無菌純水，充分混勻，用核酸提取試劑盒提取艱難擬梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 9689）核酸，具體操作步驟與糞便樣本艱難擬梭菌核酸提取相同。②稀釋。先在5個(gè)Eppendorf管中分別加入90 μL無菌純水，然后在第1個(gè)Eppendorf管中加入10 μL 0.5麥?zhǔn)蠞岫染?，充分混勻后?0 μL加入第2個(gè)Eppendorf管，用同樣的方法稀釋到第5管，稀釋后的5個(gè)Eppendorf管中的細(xì)菌濃度分別為107、106、105、104和103CFU/mL，用于LAMP法靈敏度評(píng)價(jià)。每個(gè)濃度進(jìn)行8個(gè)平行測(cè)試。

2 結(jié)果

2.1 132份糞便樣本LAMP檢測(cè)結(jié)果

132份糞便樣本均進(jìn)行了LAMP檢測(cè)。132份糞便樣本中，有110份進(jìn)行了艱難擬梭菌毒素測(cè)定，其中10份（9.09%）艱難擬梭菌毒素檢測(cè)為陽性，8份（7.27%）為弱陽性；有99份糞便樣本進(jìn)行了艱難擬梭菌培養(yǎng)，其中11份（11.11%）陽性；有113份糞便樣本進(jìn)行了腸道致病菌沙門菌和志賀氏菌培養(yǎng)，僅1份樣本檢出腸炎沙門菌。54份血液科患者的糞便樣本一般細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，有43份樣本培養(yǎng)出至少1種細(xì)菌，6份樣本培養(yǎng)出真菌，3份樣本同時(shí)培養(yǎng)出細(xì)菌和真菌，2份樣本無細(xì)菌生長。

2.2 LAMP法特異性評(píng)價(jià)結(jié)果

對(duì)未培養(yǎng)出艱難擬梭菌、培養(yǎng)出其他種類細(xì)菌或真菌的37份糞便樣本進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示，有20份樣本分離出1種細(xì)菌，8份樣本分離出2種細(xì)菌，6份樣本分離出1種真菌，3份樣本同時(shí)分離出1種細(xì)菌和1種真菌；37份樣本共檢出48株菌，LAMP的Ct值均＞10.0。見表1。

表1 LAMP法特異性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 LAMP法靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果

以5個(gè)稀釋度的艱難擬梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 9689）為模板，進(jìn)行LAMP法靈敏度試驗(yàn)，8次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著核酸濃度的降低，擴(kuò)增曲線的時(shí)間逐漸延長，當(dāng)濃度降到 104CFU/mL時(shí)，平均Ct值為12.5，最終確定LAMP法靈敏度為105CFU/mL。

2.4 LAMP法與細(xì)菌培養(yǎng)法、艱難擬梭菌毒素法檢測(cè)結(jié)果的比較

132份糞便樣本中，LAMP 法檢測(cè)陽性18例，陰性114例，陽性檢出率為13.64%。LAMP法陽性檢出率高于培養(yǎng)法（11.11%）（χ2=18.74，P＜0.05）和艱難擬梭菌毒素法（9.09%）（χ2=35.94，P＜0.05）。艱難擬梭菌陽性樣本中，LAMP法與細(xì)菌培養(yǎng)法的一致率為63.64%；與艱難擬梭菌毒素法的一致率為60%。艱難擬梭菌毒法素弱陽性樣本中，LAMP法與艱難擬梭菌毒素法的一致率為50%。見表2、表3。

表2 LAMP法與細(xì)菌培養(yǎng)法的比較 例

表3 LAMP法與艱難擬梭菌毒素法的比較 例

2.5 LAMP法檢測(cè)艱難擬梭菌的效能

以細(xì)菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，ROC曲線分析結(jié)果顯示，LAMP法判斷艱難擬梭菌陽性的曲線下面積（95%可信區(qū)間）為0.737（0.596～0.878），最佳臨界值（Ct值）為10.0。見圖1。

圖1 LAMP法檢測(cè)艱難擬梭菌的ROC曲線

3 討論

本研究結(jié)果顯示，LAMP法檢測(cè)艱難擬梭菌的陽性率（13.64%）高于細(xì)菌培養(yǎng)法（11.11%），提示采用LAMP法檢測(cè)糞便樣本可提高病原體的檢出率。LAMP法根據(jù)不同菌種的高度保守區(qū)多個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，靈敏度較高[5]。LAMP法檢測(cè)原理與細(xì)菌培養(yǎng)法不同，LAMP法通過擴(kuò)增來檢測(cè)病原菌靶基因，如果病原體的基因數(shù)達(dá)到檢測(cè)限度，無論病原體是否為活體，結(jié)果都是陽性；而培養(yǎng)法要求病原菌必須是活菌，只有優(yōu)勢(shì)菌群才能被培養(yǎng)出 來[6]。另外，消化道樣本具有復(fù)雜性，艱難擬梭菌對(duì)培養(yǎng)條件的要求高，也是導(dǎo)致培養(yǎng)分離率低的原因之一。有研究結(jié)果顯示，10份培養(yǎng)法陰性LAMP法陽性樣本中，艱難擬梭菌毒素法陽性有5份、弱陽性有2份，提示細(xì)菌培養(yǎng)可能會(huì)漏檢艱難擬梭菌，如果樣本未能及時(shí)接種，培養(yǎng)結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)假陰性[7]；另外，如患者入院前使用了抗菌藥物，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)陰 性[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在核酸提取過程中，可能會(huì)受到細(xì)胞壁和芽孢的影響，艱難擬梭菌屬于革蘭陽性專性厭氧芽孢桿菌，革蘭陽性菌細(xì)胞壁較厚，含15～50層肽聚糖；此外，芽孢對(duì)熱力、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑等因素均有強(qiáng)大的抵抗力，艱難擬梭菌核酸的提取可能會(huì)受到以上因素的影響，提取效率有所減低[9]。如果樣本中病原體核酸濃度低，達(dá)不到最低檢測(cè)限，也會(huì)導(dǎo)致LAMP法檢測(cè)結(jié)果和培養(yǎng)法結(jié)果不同。雖然分子技術(shù)被認(rèn)為是臨床診斷艱難擬梭菌感染敏感的方法之一，但在使用這種方法時(shí)，似乎不可避免地會(huì)漏掉一些培養(yǎng)陽性的病例。有研究發(fā)現(xiàn)，2 308份樣本中，有50份培養(yǎng)法陽性，而聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果為陰性，原因可能是樣本中艱難擬梭菌的核酸水平低于聚合酶鏈反應(yīng)的檢測(cè)下限所致，提示檢測(cè)限可能影響分子生物學(xué)方法檢測(cè)艱難擬梭菌的結(jié)果[10]。目前，臨床檢測(cè)艱難擬梭菌主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)法和毒素免疫學(xué)檢測(cè)，這些方法耗時(shí)長、成本高，對(duì)檢測(cè)人員的要求高，而LAMP法可快速篩查出糞便樣本中的艱難擬梭菌。

本研究也存在一定的局限性，即LAMP法不能檢測(cè)病原菌的毒性，不能區(qū)分?jǐn)y帶者和感染者。只有攜帶了含有艱難擬梭菌腸毒素TcdA和/ 或細(xì)胞毒素TcdB的艱難擬梭菌才能引起感 染[11]。但有研究發(fā)現(xiàn)，無癥狀攜帶者是艱難擬梭菌在社區(qū)和醫(yī)院環(huán)境中的重要感染源[12-13]，因非產(chǎn)毒株可在人體內(nèi)定植，所以單純檢測(cè)病原體的方法與毒素檢測(cè)方法相結(jié)合，才能更好地評(píng)估艱難擬梭菌狀態(tài)。另外，本研究納入的艱難擬梭菌陽性樣本較少，后續(xù)將收集不同等級(jí)醫(yī)院更多數(shù)量的陽性樣本，進(jìn)一步對(duì)LAMP法檢測(cè)艱難擬梭菌的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜上所述，艱難擬梭菌的3種檢測(cè)方法（厭氧培養(yǎng)、毒素法、LAMP）比較，LAMP法特異性強(qiáng)，反應(yīng)時(shí)間短，10 min即可判讀結(jié)果，且操作簡(jiǎn)單，無需特殊設(shè)備，成本低，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可用于醫(yī)療資源相對(duì)匱乏的基層機(jī)構(gòu)，也可應(yīng)用于醫(yī)院感染控制和艱難擬梭菌的早期篩查[14]。采用LAMP法快速檢測(cè)糞便中的艱難擬梭菌，可有效監(jiān)測(cè)艱難擬梭菌感染，在重癥患者和血液病患者感染預(yù)警中有一定的價(jià)值。

致謝：感謝河北燕達(dá)醫(yī)院對(duì)第一作者王詩淇的支持。