血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在黑色素瘤療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷中的價(jià)值

張 濛， 李 莎， 常艷麗， 王 魯， 徐建軍， 張青云

（北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院分子診斷中心，北京 100142）

黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)和死亡率高的特點(diǎn)。2020年，全球黑色素瘤新發(fā)病例為324 635例[1]， 我國(guó)每年約有20 000例新發(fā)病例[2]。雖然黑色素瘤的發(fā)病率低于其他常見(jiàn)惡性腫瘤，但仍以每年3%～5%的速度快速增長(zhǎng)[3]。近年來(lái)，黑色素瘤的內(nèi)科治療方法進(jìn)展迅速，酪氨酸激酶抑制劑和免疫治療藥物的應(yīng)用使得晚期黑色素瘤患者的 5年生存率從10.0%提高到38.7%[4-5]，但與黑色素瘤相關(guān)的血清標(biāo)志物研究一直處于停滯狀態(tài)。目前，除乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）可用于判斷黑色素瘤預(yù)后并被列入相關(guān)指南外，尚無(wú)其他特異的黑色素瘤血清標(biāo)志物[6]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是生理性和病理性血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。VEGF家族由5種糖蛋白組成，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子；還有3種受體，分別為VEGF受體1、VEGF受體2、VEGF受體3[7]。在這些信號(hào)分子中，VEGF-A是最重要的血管生成因子，能夠增加血管通透性、刺激血管再生，并促進(jìn)腫瘤內(nèi)新血管生成[8]。在相關(guān)研究中，VEGF一般特指VEGF-A。除在腫瘤新血管生成中發(fā)揮重要作用外，VEGF還具有自分泌功能，可作為腫瘤細(xì)胞的生存因子，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受缺氧和放療、化療等環(huán)境壓力的影響[9]。 因此，VEGF已成為許多腫瘤治療的靶點(diǎn)?？寡苌伤幬铮缲惙慰购椭亟M人血管內(nèi)皮抑制素，目前已被作為黑色素瘤的一線(xiàn)治療藥 物[6]。本研究擬探討血清VEGF在黑色素瘤患者療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年8—12月北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院黑色素瘤患者49例（黑色素瘤組），其中男22例、女27例，年齡（50.8±14.7）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)檢查確診為黑色素瘤，由2名病理醫(yī)師復(fù)核；（2）年齡≥18歲；（3）簽署知情同意書(shū)，自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝、腎功能不全；（2）處于妊娠期或哺乳期；（3）人類(lèi)免疫缺陷病毒抗體陽(yáng)性；（4）合并骨髓異常增殖、慢性血管增生等其他與原發(fā)疾病無(wú)關(guān)的重大疾病。依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版指南[10]進(jìn)行黑色素瘤TNM分期。所有患者均接受系統(tǒng)性化療，其中有25例患者的化療方案中包含抗血管生成藥物。另選取同期北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院健康體檢者182名（正常對(duì)照組），其中男62名、女120名，年齡（39.2±10.5）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往無(wú)惡性腫瘤病史；（2）年齡≥18歲；（3）采血時(shí)無(wú)腫瘤相關(guān)臨床癥狀。2個(gè)組年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

收集并整理所有患者的各項(xiàng)臨床資料，包括性別、年齡、臨床分期、化療方案、療效評(píng)價(jià)、腫瘤發(fā)病部位、是否發(fā)生潰瘍和是否有腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變。對(duì)所有患者隨訪(fǎng)24個(gè)月，記錄疾病無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival time，PFS）和總生存期（overall survival time，OS）。

采集所有黑色素瘤患者化療結(jié)束2周后、正常對(duì)照者體檢當(dāng)日的空腹靜脈血4 mL，待血液凝固后3 580×g離心15 min，分離血清， -80 ℃保存待檢。VEGF采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自北京健平九星生物醫(yī)藥科技有限公司，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每份樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)結(jié)果取均值，以高于參考區(qū)間上限（142.2 pg/mL）為陽(yáng)性。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）[11]進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，分為客觀緩解、疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析計(jì)量資料的正態(tài)性。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較經(jīng)Bonferroni校正后采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用非條件邏輯回歸分析評(píng)估校正性別、年齡后2個(gè)組之間血清VEGF陽(yáng)性率的差異。采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析不同VEGF水平患者PFS和OS的差異。采用Cox回歸分析評(píng)估各臨床病理參數(shù)對(duì)PFS和OS的影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組與黑色素瘤組血清VEGF陽(yáng)性率的差異

非條件邏輯回歸分析結(jié)果顯示，校正年齡和性別后，黑色素瘤組V E G F陽(yáng)性率[48.98%（24/49）]顯著高于正常對(duì)照組[3.85%（7/182）]（P＜0.001）。

2.2 血清VEGF陽(yáng)性率與黑色素瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

49例黑色素瘤患者中，腫瘤發(fā)病部位為肢端的占46.9%（23/49），為黏膜的占22.4%（11/49）。常見(jiàn)的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因BRAF、C-KIT、NRAS和 PDGFRA突變發(fā)生率分別為16.3%（8/49）、6.1%（3/49）、6.1%（3/49）和2.0%（1/49）。

根據(jù)血清VEGF水平是否升高將黑色素瘤患者分為VEGF正常組（25例）和VEGF升高組（24例）。血清VEGF水平升高與患者療效有關(guān)（P=0.001）。化療結(jié)束后，VEGF正常組中客觀緩解5例、疾病穩(wěn)定20例，無(wú)疾病進(jìn)展患者；VEGF升高組中疾病穩(wěn)定18例、疾病進(jìn)展6例，無(wú)客觀緩解患者。血清VEGF陽(yáng)性率與黑色素瘤患者性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位、臨床分期、是否發(fā)生潰瘍及是否有腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 血清VEGF水平與黑色素瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 血清VEGF與黑色素瘤患者預(yù)后的關(guān)系

VEGF升高組中位PFS為3個(gè)月，顯著短于VEGF正常組（9個(gè)月）（P=0.02），見(jiàn)圖1。血清VEGF水平升高和臨床分期Ⅳ期均是黑色素瘤患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。血清VEGF水平升高患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)VEGF正?；颊吒?.55倍[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）= 2.55，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為1.07～6.10]，Ⅳ期患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)比Ⅰ～Ⅲ期患者高4.64倍（HR=4.64，95%CI為1.40～15.43），見(jiàn)圖2。

對(duì)黑色素瘤患者隨訪(fǎng)24個(gè)月，其中VEGF正常組有9例（36%）患者死亡，VEGF升高組有12例（50%）患者死亡。VEGF正常組OS雖稍長(zhǎng)于VEGF升高組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.104），見(jiàn)圖3。臨床分期Ⅳ期的黑色素瘤患者OS縮短的風(fēng)險(xiǎn)比Ⅰ～Ⅲ期患者高14.52倍（HR=14.52，95%CI為2.67～79.08）， 見(jiàn)圖4。

圖1 VEGF升高組與VEGF正常組PFS比較

圖2 黑色素瘤患者PFS的影響因素

圖3 VEGF升高組與VEGF正常組OS比較

圖4 黑色素瘤患者OS的影響因素

3 討論

有研究結(jié)果顯示，東亞人群與高加索人群在黑色素瘤的病理類(lèi)型和預(yù)后方面存在許多差異，高加索人群中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型為淺表性擴(kuò)散型，其發(fā)病與陽(yáng)光照射密切相關(guān)，預(yù)后較好；而東亞人群中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型則是肢端型和黏膜型，分別占49.4%和22.6%，與本研究中的發(fā)病率（46.9%和22.5%）一致，預(yù)后相對(duì)較差[12-13]。有研究結(jié)果顯示，我國(guó)人群黑色素瘤發(fā)病和紫外線(xiàn)照射無(wú)關(guān)，遺傳因素、創(chuàng)傷、慢性刺激、生活方式的改變等是可能原因[12]。

血管生成在黑色素瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。腫瘤血管可為腫瘤組織提供新陳代謝所必需的氧和營(yíng)養(yǎng)，從而使腫瘤得以迅速生長(zhǎng)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到2～3 mm3時(shí)，腫瘤細(xì)胞無(wú)法依靠彌散獲取營(yíng)養(yǎng)，此時(shí)會(huì)分泌大量VEGF，促進(jìn)腫瘤血管生成。本研究結(jié)果顯示，黑色素瘤患者血清VEGF陽(yáng)性率顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.001）。但有研究結(jié)果顯示，VEGF的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均較低，不適用于黑色素瘤的篩查或診斷[14]。

貝伐單抗和重組人血管內(nèi)皮抑制素等抗血管生成藥物用于臨床后，使許多晚期黑色素瘤患者獲益。有研究結(jié)果表明，VEGF通路參與了多種化療藥物，如干擾素（interferon，IFN）、白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、達(dá)拉非尼和吉非替尼等的耐藥[15-18]。高劑量IFN輔助治療后血清VEGF水平下降的患者完全緩解時(shí)間更長(zhǎng)；血清VEGF水平未下降的患者則無(wú)臨床獲益[15]。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，ziv-aflibercept作為人源IgG1 Fc蛋白與VEGF受體1、VEGF受體2細(xì)胞外配體結(jié)合域的融合蛋白，可以通過(guò)耗盡血清中的VEGF，提高Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤患者對(duì)IL-2的反應(yīng)率[16]。還有研究結(jié)果顯示，BRAF抑制劑治療有效的黑色素瘤患者的血清VEGF水平顯著低于BRAF抑制劑耐藥的患者；且治療有效的患者在出現(xiàn)疾病進(jìn)展時(shí)，VEGF水平顯著高于基線(xiàn)[17]。酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼可通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/蛋白激酶B信號(hào)通路抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。因此，無(wú)論化療方案中是否加入抗血管生成藥物，血清VEGF均能較好地預(yù)測(cè)臨床 療效。

血清VEGF在許多腫瘤的預(yù)后判斷中有較好的作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，血清VEGF水平升高的黑色素瘤患者的PFS較短，且與化療方案中是否包含了抗血管生成藥物無(wú)關(guān)；血清VEGF水平升高的患者OS雖有縮短的趨勢(shì)，但與血清VEGF水平正常的患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能與本研究納入的樣本量較小和隨訪(fǎng)時(shí)間較短有關(guān)；在各臨床病理參數(shù)中，臨床分期Ⅳ期是黑色素瘤患者PFS和OS縮短的主要危險(xiǎn)因素（HR值分別為4.64、14.52，95%CI分別為1.40～15.43、2.67～79.08）。有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤患者的5年生存率分別為90%、70%、40%和＜10%，Ⅳ期患者的中位PFS僅為1.7個(gè)月[21]。因此，黑色素瘤患者一旦出現(xiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，療效和預(yù)后都極差。

本研究還存在一些不足之處：首先，缺乏黑色素瘤患者化療前VEGF基線(xiàn)數(shù)據(jù)及化療后血清VEGF動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果，導(dǎo)致對(duì)黑色素瘤療效的監(jiān)測(cè)可能不夠全面。其次，由于樣本量較小，按臨床病理參數(shù)分組可能降低了有效樣本量和統(tǒng)計(jì)學(xué)效能。因此，后續(xù)還需要深入研究，以確定動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清VEGF在黑色素瘤患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，血清VEGF在黑色素瘤療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。