乳腺癌組織中ZEB2、E-Cad表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

王曉燁， 冬國友， 劉志英

（1.唐山市婦幼保健院病理科，河北 唐山 063000；2. 唐山市婦幼保健院普外科，河北 唐山 063000）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致乳腺癌患者不良預(yù)后的主要原因[1]。 尋找乳腺癌的特異性生物標(biāo)志物，建立有效監(jiān)控癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的方法，及時(shí)干預(yù)，對(duì)于延長患者生存時(shí)間、改善預(yù)后具有重大意義。有研究結(jié)果顯示，雌激素受體（estrogen receptor，ER）、人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、孕激素受體（progestrone receptor，PR）等細(xì)胞因子在乳腺癌中呈異常表達(dá)，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)[2]。另外，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺細(xì)胞的惡性演變中發(fā)揮了主要作用[3]。抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程能明顯減弱其轉(zhuǎn)移和侵襲能力[4]。上皮型鈣黏蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）和E盒結(jié)合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2，ZEB2）等參與了EMT的調(diào)控過程。本研究擬探討ZEB2和E-Cad在乳腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲和預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年7月—2014年7月唐山市婦幼保健院接受乳腺癌根治術(shù)的患者80例，年齡32～68歲。收集所有患者術(shù)中切除的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距癌組織≤3 cm）樣本，同時(shí)收集其臨床病歷資料。通過定期電話、門診復(fù)查等形式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間從手術(shù)結(jié)束開始至2019年8月或死亡為止。本研究經(jīng)唐山市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)影像學(xué)、病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性乳腺癌，病歷資料完整；（2）均經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)前未經(jīng)放療、化療及其他免疫方法治療；（3）患者或其家屬簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他部位的惡性腫瘤；（2）有腺瘤性息肉病家族史；（3）有嚴(yán)重的肝、腎功能障礙或其他并發(fā)癥；（4）有其他遺傳性乳腺癌綜合征；（5）有免疫功能障礙或其他代謝障礙性疾?。唬?）有血液系統(tǒng)疾病。

1.2 儀器和試劑

兔抗人ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR單克隆抗體購自美國Abcam公司。免疫組化試劑盒購自南京建成生物有限公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）購自美國Santa Cruz公司，組織裂解液購自美國Millipore公司，Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。BX51T-12P01生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司），T100 PCR儀（美國伯樂公司）。

1.3 ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR蛋白表達(dá)檢測(cè)

將兔抗人ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR單克隆抗體進(jìn)行1∶500稀釋，嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行病理切片及染色，在BX51T-12P01生物顯微鏡下觀察，并記錄結(jié)果。

1.4 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]：根據(jù)染色細(xì)胞密度進(jìn)行評(píng)分，陽性細(xì)胞比例＜25%為0分，25%～ ＜50%為1分，50%～＜75%為2分，75%～100%為3分；根據(jù)組織染色程度進(jìn)行評(píng)分，無色為0分，淡黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分。免疫組化評(píng)分為兩者評(píng)分的乘積。0～3分為蛋白表達(dá)陰性，4～9分為蛋白表達(dá)陽性。

1.5 癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)癌組織和癌旁組織ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA的表達(dá)。取適量乳腺組織和癌旁組織樣本，研碎、裂解后按Trizol試劑盒要求提取總RNA[6]。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。采用SYBR Green熒光定量試劑盒和T100 PCR儀檢測(cè)目的基因的表達(dá)。引物由北京力高泰科技有限公司合成。ZEB2 mRNA上游引物為5'-CTCCCAGGTCTGGTGTGTTG-3'，下游引物為5'-GAGGTCTAGGTAGGAGGTGAAG-3'；E-Cad mRNA：上游引物為5'-ACTGTCCGAAT- TGACATCATGG-3'，下游引物為5'-TTCTGAG- CTTCCACCAAAACTC-3'；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物為5'-GGAG- CGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫印跡法檢測(cè)癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad蛋白的表達(dá)。取癌組織和癌旁組織樣本，加入組織裂解液，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，置于沸水中變性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉清洗3次后，在封閉液中孵育30 min，加入一抗（ZEB2、E-Cad，1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜，加入二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）分析各條帶的灰度值。

1.7 乳腺癌分子分型方法

參照相關(guān)國際共識(shí)[7]中的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)免疫組化結(jié)果進(jìn)行乳腺癌分子分型：ER陽性、PR陽性表達(dá)≥20%、HER-2陰性定義為Luminal A型；ER或PR陽性、HER-2陽性定義為Luminal B型；ER和PR陰性、HER-2陽性定義為HER-2過表達(dá)型；ER、PR和HER-2均陰性定義為基底樣型。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估乳腺癌組織ZEB2與E-Cad的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier生存曲線分析ZEB2、E-Cad表達(dá)與乳腺癌患者生存率之間的關(guān)系。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析乳腺癌患者5年生存率的影響因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析ZEB2和E-Cad判斷乳腺癌預(yù)后的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織ZEB2、E-Cad陽性表達(dá)的比較

免疫組化結(jié)果顯示，癌組織ZEB2呈陽性表達(dá)，E-Cad呈陰性表達(dá)；癌旁組織ZEB2呈陰性表達(dá)，E-Cad呈強(qiáng)陽性表達(dá)。癌組織ZEB2陽性率顯著高于癌旁組織（P＜0.001），E-Cad陽性率顯著低于癌旁組織（P＜0.001）。見圖1、表1。 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織ZEB2表達(dá)與E-Cad表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.265，P=0.018）。

圖1 癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果（×400）

2.2 癌組織與癌旁組織ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

癌組織ZEB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織（P＜0.05），E-Cad mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織（P＜0.05）。見圖2。

2.3 不同臨床病理參數(shù)乳腺癌患者之間ZEB2、E-Cad陽性表達(dá)的比較

ZEB2表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、HER-2表達(dá)均有關(guān)（P＜0.05），與年齡、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)、PR表達(dá)、分子分型、病理類型、組織學(xué)分級(jí)均無關(guān)（P＞0.05）。E-Cad表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、ER表達(dá)、PR表達(dá)、HER-2表達(dá)均有關(guān)（P＜0.05），與年齡、腫瘤直徑、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移、病理類型均無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表1 癌組織與癌旁組織ZEB2、E-Cad陽性表達(dá)的比較

圖2 癌組織與癌旁組織ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

表2 不同臨床病理參數(shù)的乳腺癌患者之間ZEB2、E-Cad陽性表達(dá)的比較

2.4 ZEB2、E-Cad表達(dá)與乳腺癌患者總生存率的Kaplan-Meier生存曲線分析

隨訪結(jié)果顯示，8 0例乳腺癌患者死亡21例，5年總生存率為73.75%（59/80）。癌組織ZEB2陰性乳腺癌患者的5年總生存率為83.33%，顯著高于ZEB2陽性患者（72.06%）（P＜0.05）。癌組織E-Cad陽性乳腺癌患者的5年總生存率為80.00%，高于陰性表達(dá)患者（72.86%）（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 ZEB2陰性和陽性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

圖4 E-Cad陰性和陽性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.5 影響乳腺癌患者預(yù)后的因素

以腫瘤直徑（＜1.5 cm為0，≥1.5 cm為1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=1，沒有=0）、TNM分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、ZEB2表達(dá)（陽性=1，陰性=0）、E-Cad表達(dá)（陽性=1，陰性=0）、ER表達(dá)（陽性=1，陰性=0）、HER-2表達(dá)（陽性=1，陰性=0）、PR表達(dá)（陽性=1，陰性=0）作為自變量，以患者的5年生存率為因變量，進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、ZEB2表達(dá)、E-Cad表達(dá)是影響乳腺癌患者預(yù)后的因素[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）分別為3.47、6.49、2.35、0.15，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為2.48～5.67、1.17～8.67、2.00～5.64、0.08～0.78]。見表3。

表3 乳腺癌患者預(yù)后影響因素分析

2.6 ZEB2、E-Cad單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)判斷乳腺癌患者預(yù)后的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，ZEB2、E-Cad單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)判斷乳腺癌患者5年生存的曲線下面積分別為0.618、0.638、0.827，敏感性分別為73.5%、72.9%、84.5%，特異性分別為77.8%、76.9%、83.7%。見圖5。

圖5 ZEB2、E-Cad單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)判斷乳腺癌患者5年生存的ROC曲線

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。尋找能反映乳腺癌病變及術(shù)后效果的分子標(biāo)志物，進(jìn)行個(gè)體化診斷和預(yù)后預(yù)警是目前乳腺癌診療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。EMT是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的重要過程[8]。有研究結(jié)果顯示，EMT廣泛參與了腫瘤細(xì)胞增殖、免疫逃逸和腫瘤血管新生等生物學(xué)行為，是腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵[9]。

穿膜糖蛋白E-Cad主要介導(dǎo)細(xì)胞間質(zhì)之間的特異性連接，是腫瘤細(xì)胞EMT中的關(guān)鍵因子，對(duì)維持上皮細(xì)胞的正常極性、完整性以及抑制細(xì)胞逃逸有重要作用[10]。E-Cad表達(dá)降低是EMT啟動(dòng)的標(biāo)志。有研究結(jié)果顯示，E-Cad蛋白表達(dá)異常造成的E-Cad功能障礙與多種腫瘤（鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌等）患者的不良預(yù)后和生存率降低密切相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織E-Cad mRNA及蛋白的表達(dá)均低于癌旁組織（P＜0.05）；E-Cad表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、ER表達(dá)、PR表達(dá)、HER-2表達(dá)、分子分型、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，E-Cad表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后的影響因素。提示E-Cad表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。

胞核轉(zhuǎn)錄因子ZEB2是E盒結(jié)合鋅指蛋白家族成員之一。ZEB2介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的EMT過程，可通過調(diào)控EMT來實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn) 移[12]。XAVIER等[13]的研究結(jié)果顯示，ZEB2的高表達(dá)可直接提高犬乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。ZHOU等[14]的研究結(jié)果顯示，ZEB2可調(diào)控胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)EMT。羅慶豐等[15]的研究結(jié)果顯示，ZEB2可與鼻咽癌細(xì)胞胞核內(nèi)E-基因的啟動(dòng)子特異性結(jié)合，抑制E-Cad蛋白的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)EMT的進(jìn)程，從而增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織ZEB2 mRNA及蛋白表達(dá)均高于癌旁組織（P＜0.05）；ZEB2表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、HER-2表達(dá)有關(guān)（P＜0.05）；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，ZEB2表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后的影響因素；Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，ZEB2表達(dá)與E-Cad表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.265，P=0.018）。提示ZEB2可能參與了乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。此外，本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，ZEB2、E-Cad單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)判斷乳腺癌患者5年生存的曲線下面積分別為0.618、0.638、0.827，敏感性分別為73.5%、72.9%、84.5%，特異性分別為77.8%、76.9%、83.7%。

綜上所述，乳腺癌組織ZEB2和E-Cad表達(dá)異常，與乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為及患者5年生存率密切相關(guān)，或可用于評(píng)估乳腺癌預(yù)后潛在指標(biāo)。