一株產(chǎn)低溫脂肪酶酵母菌的鑒定及酶學(xué)性質(zhì)

史程風(fēng)，賈冉冉，閻振麗，惠豐立

（1 南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061；2 河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南 南陽 473000）

脂肪酶（EC3.1.1.3）又稱為三?；视退饷?，不僅可催化甘油三酯水解為游離脂肪酸和甘油，還能催化酯化、酯交換、酸解、醇解和氨解等反應(yīng)。作為水解酶，脂肪酶參與的反應(yīng)過程中不需要輔因子，表現(xiàn)出良好的化學(xué)、區(qū)域以及對映選擇性，因而成為最通用的生物催化劑。

目前工業(yè)上應(yīng)用廣泛的脂肪酶是中高溫脂肪酶。中高溫脂肪酶在30～50℃之間表現(xiàn)出較高酶活性，在0℃時幾乎為零，而低溫脂肪酶在0～20℃范圍內(nèi)就可以表現(xiàn)出較高的酶活性，在30℃左右酶活性達(dá)到最高。低溫脂肪酶為適應(yīng)寒冷環(huán)境進(jìn)化出了一系列的結(jié)構(gòu)特征，表現(xiàn)為高靈活性、高彈性，具有高催化活性、低活化能、高底物親和力、熱不穩(wěn)定性等特點，在低溫環(huán)境中具有廣泛的應(yīng)用前景。

在生物質(zhì)能源領(lǐng)域，低溫脂肪酶催化酯化反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油可代替目前以酸或堿為催化劑的化學(xué)法，可解決工藝復(fù)雜、能耗高、污染大等制約其發(fā)展的瓶頸，且使生物柴油具有良好的發(fā)動機低溫啟動性能。在養(yǎng)殖業(yè)，低溫脂肪酶水解油脂產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可作為生理功能添加劑替代傳統(tǒng)抗生素，用于維護(hù)腸道健康，解決仔豬斷奶應(yīng)激問題。低溫脂肪酶還可解決溫度處理帶來的諸多難題，如在油脂、啤酒及奶制品等加工過程中可避免長時間高溫滅活酶而影響其質(zhì)量和風(fēng)味。在皮制品工業(yè)，低溫脂肪酶可以實現(xiàn)對皮革低溫脫脂，省卻加熱和冷卻步驟，在不損壞皮革質(zhì)量的基礎(chǔ)上省時省耗。工業(yè)廢水為自然溫度，甚至10℃以下，利用低溫脂肪酶可實現(xiàn)冷水除污，有利于節(jié)省能源，保護(hù)環(huán)境。

現(xiàn)有報道的低溫脂肪酶最適反應(yīng)溫度一般為24～37℃，主要來源于海洋深處、極地和高山地區(qū)等極端環(huán)境中的低溫微生物，主要包括耶式酵母屬（）、紅酵母屬（）、假單胞菌屬（）、耶爾森氏菌（）、芽孢桿菌屬（）、曲霉屬（）、沙雷氏菌屬（）、 伯克霍爾德氏菌屬（）等。為了尋找工業(yè)上有應(yīng)用價值的低溫脂肪酶，國內(nèi)對其產(chǎn)生菌已進(jìn)行了較為深入的研究，但主要是細(xì)菌。謝玉婷等對伯克霍爾德氏菌sp.JXJ-16低溫脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，該酶在35℃、pH 8.5～9 有最大水解活性，對硝基苯酚辛酸酯為最適底物。王春雨等研究了蘇云金芽胞桿菌sp.CZW001 低溫脂肪酶的性質(zhì)，該低溫脂肪酶最適反應(yīng)溫度為25℃，最適反應(yīng)pH為8，對Ca有較大依賴性。國外學(xué)者Park 等篩選出一株嗜溫畢赤酵母NRRL Y-7723，但僅對該菌產(chǎn)低溫脂肪酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。Maharana等從南極東部湖泊沉積物樣品中分離得到一株耐冷紅酵母sp. Y-23，該菌所產(chǎn)的低溫脂肪酶最適反應(yīng)pH 為8，最適反應(yīng)溫度為35℃，且在pH為5、溫度20℃時更具穩(wěn)定性。

本文作者課題組從實驗室所保藏的55 株產(chǎn)低溫脂肪酶菌株中篩選出一株高產(chǎn)酵母菌株NYNU 19160，對該菌株進(jìn)行鑒定，并對該菌株所產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行初步純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)，為工業(yè)低溫脂肪酶資源的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

55 株產(chǎn)低溫脂肪酶酵母菌株是從我國東北及西北地區(qū)采集的土壤樣品中分離獲得，保藏于本實驗室。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：棕櫚酸對硝基苯酯（PNPP），上海麥克林生化有限公司；無水乙醇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；阿拉伯膠，美國生命科學(xué)與高科技集團(tuán)公司；TritonX-100，北京索萊寶科技有限公司；Ezup 柱式酵母基因組DNA 抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：YQT-33QCE 全自動生化培養(yǎng)箱，上海申安醫(yī)療器械設(shè)備有限公司；STIK 高壓蒸汽滅菌器，施都凱儀器設(shè)備上海有限公司；ZWYRD2403恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；磁力攪拌器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YM 液體培養(yǎng)基（g/L）：無水葡萄糖10，麥芽粉3，酵母粉3，蛋白胨5，pH自然。

YM 固體培養(yǎng)基：YM 液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂20g/L。

羅丹明B 篩選培養(yǎng)基（g/L）：無水葡萄糖10，麥芽粉3，酵母粉3，蛋白胨5，瓊脂20，羅丹明B 0.01，三丁酸甘油酯乳化液1%（體積分?jǐn)?shù)），pH自然。三丁酸甘油酯乳化液參照文獻(xiàn)[23]制備。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：無水葡萄糖10，玉米漿40，三水磷酸氫二鉀6.6，硝酸鈉5，三丁酸甘油酯2.5，吐溫80 1，pH 7.0。

YCBS 固體培養(yǎng)基（g/L）：酵母碳源基礎(chǔ)17.9，硫酸銨0.1，瓊脂20。

5%麥芽粉固體培養(yǎng)基（g/L）：麥芽粉50，瓊脂20。

1%玉米瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：玉米粉50，瓊脂10（需將玉米粉70℃水浴至水發(fā)白，用紗布過濾后添加瓊脂配制）。

2%玉米瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：玉米粉50，瓊脂20（需將玉米粉70℃水浴至水發(fā)白，用紗布過濾后添加瓊脂配制）。

氮源同化測試基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BMN）（g/L）：酵母碳源基礎(chǔ)17.9。

碳源同化測試基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BMC）（g/L）：酵母氮源基礎(chǔ)10。

YEPD 固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，瓊脂20。

維生素基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基（g/L）：維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基17，瓊脂20。

1.2 菌株篩選

（1）初篩 將待篩選菌株在YM固體培養(yǎng)基上涂布平板，15℃培養(yǎng)3天，挑取單菌落轉(zhuǎn)移到羅丹明B 篩選平板上，15℃培養(yǎng)3 天，于350nm 紫外光下觀察。依據(jù)培養(yǎng)平板上形成的熒光圈的早晚和熒光圈直徑與菌落直徑比值的大小進(jìn)行篩選，直徑比大的菌落表明水解脂肪酶能力強。

（2）復(fù)篩 將初篩的菌株挑取單菌落接入YM液體培養(yǎng)基，15℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)1～2天，以10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，15℃、200r/min 搖瓶發(fā)酵3～7 天后，12000r/min 離心20min，取上清液即得粗酶液，測定酶活性。

酶活性測定參考Margesin 等的測定方法并略作修改。取棕櫚酸對硝基苯酯（PNPP）溶液0.3mL（ 體 系 為 0.0378g PNPP、 0.1g 阿 拉 伯 膠、0.4mLTritonX-100溶于50mmol pH7.0的Tris-HCl 緩沖液中，加熱至溶解，定容至100mL），待測酶液0.2mL，充分混合后15℃條件下反應(yīng)15min，立即取出加入0.5mL無水乙醇終止反應(yīng)。分別取200μL反應(yīng)液加入96孔板中，滅活的酶液作為空白對照，測定410nm 下吸光值。1 個酶活性單位定義為：在15℃條件下，脂肪酶水解棕櫚酸對硝基苯酯，每分鐘生成1μmol對硝基苯酚所需酶量，單位以U表示。

1.3 形態(tài)和培養(yǎng)特征

菌株NYNU 19160的形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征的觀察依據(jù)文獻(xiàn)[25]進(jìn)行。在YM固體培養(yǎng)基平板上劃線，15℃培養(yǎng)4～7天后，觀察菌落形態(tài)。在YM液體培養(yǎng)基中，15℃靜置培養(yǎng)3天后，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。在1%玉米瓊脂培養(yǎng)基中，15℃培養(yǎng)15～20天，定期鏡檢，觀察假菌絲。在YCBS 固體培養(yǎng)基、5%麥芽粉固體培養(yǎng)基和2%玉米瓊脂培養(yǎng)基上，15℃培養(yǎng)2～10周，定期鏡檢，觀察擔(dān)孢子。

1.4 生理生化特征

參考文獻(xiàn)[25-26]對菌株NYNU 19160進(jìn)行生理生化鑒定。除了特別說明外，菌株培養(yǎng)溫度均為15℃。利用杜氏管發(fā)酵法進(jìn)行糖發(fā)酵測試，連續(xù)2周每天觀察記錄杜氏管中氣泡現(xiàn)象。分別采用BMN 和BMC 培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，7 天后進(jìn)行碳源、氮源轉(zhuǎn)接實驗，觀察記錄15 天內(nèi)菌株同化或生長情況。設(shè)定4～45℃溫度梯度，YEPD固體培養(yǎng)基作為溫度測試培養(yǎng)基。利用維生素基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基進(jìn)行維生素生長測試，配制生長測試培養(yǎng)基進(jìn)行其他生長測試實驗。

1.5 ITS和26S rDNA序列分析

1.5.1 基因組DNA的提取

挑取單菌落于YM 液體培養(yǎng)基中，15℃、200r/min過夜培養(yǎng)24h，離心棄上清液，收集菌體。提取基因組DNA 操作步驟依據(jù)酵母基因組DNA 抽提試劑盒進(jìn)行。

1.5.2 ITS和26S rDNA PCR擴增和測序

利用引物ITS1（5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′） 和ITS4 （5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）PCR 擴增ITS 區(qū)域序列；利用引物NL1 （5′-TAA GCG GAG GAA AAG-3′） 和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′）PCR 擴增26S rDNA D1/D2區(qū)域序列。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min，30 個循環(huán)（94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s）72℃延伸5min。擴增完成后以1%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，送到生工生物工程技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司測序。

1.5.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

通過NCBI 中blastn 工具，將測序得到的菌株NYNU 19160 ITS 序列以及26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列在GeneBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列相似搜索，利用Clustal X軟件按照最大同源性的原則，將親緣關(guān)系較近的典型菌株作為參比對象進(jìn)行比對。利用MEGA 7.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選擇1000 次重復(fù)取樣進(jìn)行進(jìn)化樹拓?fù)浞治?，確定進(jìn)化地位。

1.6 脂肪酶的純化

將發(fā)酵液離心取上清液即得粗酶液，在冰水浴及磁力攪拌條件下緩慢加入研磨好的硫酸銨粉末，添 加 至 飽 和 度（20%～100%）， 靜 置30min，10000r/min冷凍離心，取上清液測定酶活性。以上清液中的酶活性對硫酸銨飽和度作圖。根據(jù)確定出的硫酸銨飽和度進(jìn)行分級沉淀，沉淀復(fù)溶于PBS（50mmol/L，pH7.0）中，4℃透析12～14h 后進(jìn)行濃縮，0.22μm 濾膜過濾后，測定酶活性并使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，計算酶純化倍數(shù)和活性回收率。保存純化后的酶液用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

經(jīng)過羅丹明B 平板初篩，篩選出12 株熒光圈與菌落直徑比值較大的菌株（表1）。通過對上述菌株進(jìn)行復(fù)篩，菌株NYNU 19160產(chǎn)脂肪酶活性較高，達(dá)到34.47U/mL。

表1 不同的菌株脂肪酶活性

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)與培養(yǎng)特征

菌株NYNU 19160 在YM 固體培養(yǎng)基中，15℃培養(yǎng)5 天后，菌落呈奶油色，表面光滑且有光澤，具有完整邊緣。在YM 液體培養(yǎng)基15℃靜置培養(yǎng)3天后鏡檢，細(xì)胞呈卵圓形（圖1），單個或成對出現(xiàn)，細(xì)胞大小為[(3～6)μm×(3～5)μm]，呈極性出芽。在1%玉米瓊脂培養(yǎng)基中15℃培養(yǎng)15～20 天，定期鏡檢，不形成假菌絲。在YCBS 固體培養(yǎng)基、5%麥芽粉固體培養(yǎng)基和2%玉米瓊脂培養(yǎng)基中15℃培養(yǎng)2～10周，定期鏡檢，不形成擔(dān)孢子。

圖1 菌株NYNU 19160的細(xì)胞形態(tài)

2.2.2 生理生化特征

菌株NYNU 19160不發(fā)酵糖?？衫靡野贰⑾跛猁}、D-色氨酸、亞硝酸鹽、氨基葡萄糖、肌酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、蔗糖、木糖醇、D-麥芽糖、5-酮-D-葡糖糖鹽、水楊苷、L-阿拉伯糖醇，不可利用尸胺、肌酐、L-賴氨酸、L-山梨糖、甲醇、D,L-乳酸，弱同化咪唑、D-阿拉伯糖，延遲同化核糖醇、檸檬酸、乙醇。在維生素基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基上可生長。在15～25℃下生長較快，在40～45℃下不生長。在添加0.01%放線菌酮培養(yǎng)基中弱生長，在添加0.1%放線菌酮、1%乙酸培養(yǎng)基中均不可生長（表2）。菌株NYNU 19160形態(tài)和生理生化特征與最相近。

表2 菌株NYNU 19160的生理生化特征

2.2.3 ITS和26S rDNA序列分析

擴增菌株NYNU 19160 的ITS 和26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列，序列長度分別為504 bp 和597 bp。在GeneBank 核酸數(shù)據(jù)庫中，通過NCBI 中blastn 工具進(jìn)行比對后，發(fā)現(xiàn)菌株NYNU 19160 的ITS 序列與EX F-4087的相似性為100%，26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列與EX F-4087相似性為99.83%。圖2 為菌株NYNU 19160 與所 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā)育樹。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株NYNU 19160與EX F-4087聚為一群。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將菌株NYNU 19160鑒定為。

圖2 菌株NYNU 19160 ITS和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 低溫脂肪酶的純化

菌株NYNU19160 硫酸銨沉淀上清液中低溫脂肪酶活性變化曲線表明，飽和度為20%～60%時，酶活性較高，其中飽和度為30%時酶活性最高，為65.6U/mL，隨著硫酸銨飽和度增加到70%，酶活性急劇下降，當(dāng)飽和度達(dá)到90%時，酶活性很低，表明該飽和度下大部分脂肪酶已沉淀（圖3）。因此可選用30%飽和度進(jìn)行硫酸銨一級沉淀，以除去部分雜質(zhì)蛋白，選用90%飽和度進(jìn)行硫酸銨二級沉淀。

圖3 菌株NYNU 19160硫酸銨沉淀上清液中脂肪酶活性變化曲線

經(jīng)過粗酶液、一級沉淀上清液以及濃縮后酶液的總蛋白質(zhì)量和總酶活性的計算，得出純化后酶液的比活性為97.93U/mg，純化倍數(shù)為2.12，酶活性回收率為33.5%，見表3。

表3 菌株NYNU 19160低溫脂肪酶純化結(jié)果

2.4 低溫脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 酶最適反應(yīng)溫度及溫度對酶穩(wěn)定性的影響

取純化后的酶液，于0～50℃條件下分別進(jìn)行酶反應(yīng)， 測定酶活性。 結(jié)果表明， 菌株NYNU19160 所產(chǎn)脂肪酶在20℃條件下酶活性達(dá)到最高，0℃仍有12%的相對酶活性，25～35℃條件下相對酶活性在60%以上，證明該酶符合低溫酶的特性（圖4）。將酶液在不同溫度下保溫不同時間后測定剩余酶活性，菌株NYNU19160 脂肪酶在20～30℃條件下酶活性穩(wěn)定性最好，但熱穩(wěn)定性較差，在50℃下保溫30min酶活性損失80%（圖5）。

圖4 溫度對低溫脂肪酶活性的影響

圖5 溫度對低溫脂肪酶穩(wěn)定性的影響

2.4.2 酶最適反應(yīng)pH及其酸堿穩(wěn)定性

在最適反應(yīng)溫度條件下，將純化后的酶液置于不同pH反應(yīng)體系中，測定酶活性。pH為7～8.5時酶活性達(dá)80%以上，最適反應(yīng)pH為7.5。將酶液在不同pH 緩沖液中保溫處理1h，以原酶活性為100%，測定剩余酶活性。隨著pH增大，酶穩(wěn)定性逐漸提高，pH 為7～8 時仍存留80%酶活性，pH為4 以下時酶活性幾乎喪失，剩余3.87%，證明菌株NYNU19160脂肪酶在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定（圖6）。

圖6 低溫脂肪酶最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性

2.4.3 金屬離子對酶活性的影響

將Mg、Ni、Mn、Ba、Zn、K、Li、Na、Ca、Co、Fe、Cu、Pb、La添加到酶反應(yīng)體系中，使終濃度為1mmol/L，以未與金屬離子混合的原酶液作為對照，在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)15min后測定酶活性，考察不同金屬離子對菌株NYNU19160 脂肪酶的影響。由圖7 可知，Co、Cu、La可明顯促進(jìn)酶活性，其中Cu對酶活性促進(jìn)作用最為顯著，達(dá)到186%，Li可能影響了該酶蛋白構(gòu)象，明顯抑制了酶活性，使酶活性降低近60%。

圖7 金屬離子對低溫脂肪酶活性的影響

2.4.4 有機溶劑對酶活性的影響

添加一定濃度的有機溶劑可在酶促有機合成應(yīng)用中起重要作用。由圖8 可以看出，菌株NYNU19160 脂肪酶活性隨著有機溶劑極性減弱而降低。苯與正己烷均對該酶有抑制作用，30%的正己烷在4℃混合1h 酶活性僅剩30%，而乙腈、甲醇、乙酸、異丙醇均對酶活性有促進(jìn)作用，但濃度增大抑制了酶活性，正丁醇、乙醚、乙醇對酶活性促進(jìn)作用不明顯。

圖8 不同有機溶劑對低溫脂肪酶的影響

2.4.5 底物特異性

選取不同碳鏈長度的對硝基苯酚酸酯作為底物分別進(jìn)行酶反應(yīng)，結(jié)果如圖9所示。該脂肪酶對對硝基苯酚丁酸酯（-nitrophenyl butyrate，NPC4）催化活性最大，對對硝基苯酚硬脂酸酯（nitrophenyl Stearate,NPC18）催化活性最小，說明菌株NYNU19160脂肪酶對中短鏈底物具有特異性。

圖9 低溫脂肪酶對不同碳鏈對硝基苯酚酯的水解活性

3 結(jié)論

本文從實驗室所保藏的55 株產(chǎn)低溫脂肪酶酵母菌株中篩選出一株高產(chǎn)菌株，對該菌株進(jìn)行了鑒定，經(jīng)初步純化后，研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下。

（1）通過初篩和復(fù)篩獲得一株低溫脂肪酶高產(chǎn)酵母菌株NYNU 19160，通過形態(tài)學(xué)、生理生化以及ITS和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析，將該菌株鑒定為。

（2）粗酶液通過硫酸銨分級沉淀、透析、濃縮，純化后酶液比活性為97.93U/mg，純化倍數(shù)為2.12，酶活性回收率為33.5%。

（3）菌株NYNU 19160 產(chǎn)生的脂肪酶最適反應(yīng)溫度為20℃，在溫度20～30℃的條件下，酶較穩(wěn)定，但對熱敏感，在50℃下處理30min僅殘留20%的酶活性；酶的適宜作用pH范圍在6.5～8.5，最適pH 為7.5；Cu對該脂肪酶有顯著的激活作用，而Li顯著抑制了酶活性；該脂肪酶適宜與極性較強且濃度較低的有機溶劑混合反應(yīng)，如乙腈、甲醇、乙酸等，而苯和正己烷則對酶活性抑制作用較強；對硝基苯酚丁酸酯為該脂肪酶的最適反應(yīng)底物。

（4）該脂肪酶為典型低溫堿性脂肪酶，在生物質(zhì)能源、洗滌劑、皮制品、廢水處理等低溫堿性環(huán)境中具有廣泛的應(yīng)用前景。