生姜莖葉提取物對高粱蚜生長發(fā)育及防御酶活性的影響

劉奕清，劉續(xù)立*，房升又，馬佳偉,2，蔡小東,2，賈切，樂有章

1.長江大學香辛作物研究院，湖北 荊州 434025 2.荊州佳之源生物科技有限公司，湖北 荊州 434025 3.武漢市農業(yè)科學院林業(yè)果樹研究所，湖北 武漢 430073

蚜蟲(Aphidoidea)是一種植食性昆蟲，因其嚴重危害植株和易大面積傳播的特點，已成為一種世界性害蟲[1]。蚜蟲在生長發(fā)育過程中會吸食植物汁液、蛻皮和分泌蜜露，這些行為會影響植物光合作用，同時還會導致病毒病在田間作物上傳播，造成農作物品質下降，減產甚至絕收[2,3]。高粱蚜(MelanaphissacchariZehntner)屬半翅目蚜科，分布于世界各地，主要為害高粱和玉米等多種作物，一般從下部葉片向上蔓延，刺吸汁液，排出大量蜜露，傳播高粱紅條病毒病。目前，主要施用化學農藥對高粱蚜進行防治[4]，但化學農藥往往存在毒性強、農藥殘留、污染環(huán)境和危害人體健康等問題，以致于科學家迫切希望尋找防治害蟲的綠色策略[5,6]。植物源殺蟲劑因其生態(tài)友好、無殘留、可生物降解等特性而逐漸引起科學家的關注[7]。隨著對植物農藥的深入研究，發(fā)現植物提取物可作為殺蟲劑、驅蟲劑和引誘劑來控制害蟲；也可作為生長抑制劑來調控害蟲的生長發(fā)育[8]。例如，香茅精油微乳液可以顯著抑制朱砂葉螨的產卵[9]，南非醉茄根提取物對赤擬谷盜的生長、發(fā)育、蛻皮和變態(tài)均有抑制作用[10]，紫莖澤蘭粗提物對草地貪夜蛾的生長發(fā)育及繁殖也有顯著的影響[11]。因此，植物源殺蟲劑是探索蚜蟲防治的重要途徑之一。

生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)作為藥食兩用的香辛作物，在我國中部、東南部和西南部地區(qū)均有種植。生姜中富含各種功能性成分，具有很強的殺菌、殺蟲和驅蟲特性[12]。例如生姜提取物可以顯著抑制果蠅的交配[13]，也能抑制粉虱的產卵，驅趕粉虱的成蟲[14]，姜精油能對小菜蛾表現出較強的毒性和驅避性[15]。因此，生姜提取物作為植物源農藥具有潛在的開發(fā)應用前景。目前，對生姜的利用多在生姜的姜塊，而生姜地上莖葉在采收時往往被隨意丟棄于田間。據長江大學香辛作物研究院近年來田間調查顯示，當生姜種植田附近的辣椒、菜豆、玉米、花椒等農作物有蚜蟲種群發(fā)生時，而生姜植株莖葉上卻未見蚜蟲危害，但生姜作物的殺蟲作用和殺蚜機理卻鮮有報道。因此，本研究以生姜莖葉作為提取材料，以高粱蚜(MelanaphissacchariZehntner)作為靶標害蟲，研究生姜莖葉提取物(Ginger shoot extract，GSE)對高粱蚜生長發(fā)育和防御酶活性的影響，以期為開發(fā)基于生姜的植物源殺蟲劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試蚜和植物

無翅成蚜種群采自湖北省荊州市太湖農場試驗基地的玉米植株上，經中國農業(yè)大學植物保護學院黃欣蒸老師鑒定為高粱蚜。蚜蟲接種在實驗室種植的菜豆植株上，于(25 ± 5)℃、相對濕度約(65 ± 5)%、光周期12h(L)：12h(D)的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，繁育5代后挑選7日齡的蚜蟲用于試驗。生姜品種為鳳頭姜，購自湖北省恩施市宣恩縣李家河鎮(zhèn)菜市場，在溫室中進行種植，待生長至8～10片真葉時收集鳳頭姜的莖葉用于試驗。

1.2 生姜莖葉提取物(GSE)的制作

采用索氏抽提法，將生姜莖葉樣品烘干磨碎，樣品分為5份，每份5g，放入折好的濾紙中，濾紙塞入抽濾瓶中，再往瓶中以質液比1∶10的比例加入50mL無水乙醇作為提取劑，設置溫度為80℃，抽提6h后，提取液移至圓底燒瓶，打開旋轉蒸發(fā)儀，溫度設置為80℃，濃縮至稠膏狀，收集提取物進行稱重。重復以上步驟，增加試驗樣品量，-80℃保存。

1.3 高粱蚜產仔數、蛻皮數、死亡率和體重的測定

采用葉碟法[16]進行測定。將生姜莖葉提取物(GSE)用10%的乙醇配制成濃度分別為5、10、15mg/mL的溶液，隨機選取15只無翅成蚜和30只無翅若蚜(成蚜選取7日齡蚜蟲，若蚜選用試驗中成蚜繁殖的蚜蟲)，置于裝有葉子圓片的培養(yǎng)皿(直徑9cm，高度1.5cm)中。然后將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中[溫度(22 ± 2)℃，相對濕度(65 ± 5)%，光周期12h(L)：12h(D)]。以10%乙醇為對照(CK)，將各處理的葉片在不同溶液中浸泡3～5s，每個處理重復3次。培養(yǎng)1、3、5d后測定產仔數、蛻皮數和若蚜死亡率，并在培養(yǎng)0、1、3、5d測定10蚜重。產仔數、蛻皮數和體重的下降比例(抑制率P)均按對照組與處理組觀測值之差與對照組觀測值之比進行計算。各處理組的若蚜死亡率和校正死亡率按以下公式計算：

(1)

(2)

式中:P1為死亡率;K為每個時間點內總死亡蟲數;N為處理總蟲數；P2為校正死亡率;Pi為處理組死亡率;P0為對照組死亡率。

如果對照死亡率低于5%，則不需要校正；如果對照死亡率在5%～20%之間，按式(2)進行校正；如果對照死亡率超過20%，則需要重新進行試驗。

1.4 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性測定

同樣采用葉碟法測定在15mg/mL溶液處理下高粱蚜體內SOD、POD和AChE的活性，在1、3、5d時收集存活的蚜蟲，-80℃保存。SOD、POD和AChE的樣品制備及活性檢測均按照各酶活檢測試劑盒說明書進行操作(南京建成生物工程研究所，A001-1-1、A084-1-1；蘇州格銳思生物科技有限公司，G0907F)。

1.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據整理，SPSS 20.0軟件用于方差分析和Tukey’s HSD多重比較，SigmaPlot 14.0軟件用于生成圖形。

2 結果與分析

2.1 GSE對高粱蚜產仔數的影響

如圖1所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE飼喂高粱蚜成蚜5d內，其產仔數相比對照(CK)呈下降趨勢，且隨著GSE濃度的升高，對高粱蚜產仔數的抑制作用越強，15mg/mL的GSE飼喂與CK的產仔數呈顯著差異(P<0.05)。飼喂1d時，5、10、15mg/mL的GSE處理下高粱蚜的產仔數與CK無顯著差異。飼喂3d時，3種濃度GSE處理下的高粱蚜產仔數均顯著低于CK，且在15mg/mL的GSE處理下高粱蚜的產仔數最低，為9.33個。飼喂5d時，15mg/mL的GSE處理下高粱蚜的產仔數顯著低于其他2個濃度，且相比CK產仔數下降了58.58%，而5mg/mL和10mg/mL的GSE處理下高粱蚜的產仔數與CK無顯著差異。由此表明，整個處理期間GSE對高粱蚜的產仔數有抑制作用，但隨著處理時間的延長，5mg/mL和10mg/mL的GSE對高粱蚜產仔數相比CK的抑制效果不明顯，15mg/mL的GSE對高粱蚜的產仔數抑制效果相比CK有顯著區(qū)別，且抑制作用最強。

注：不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05),圖2～4同。 圖1 不同濃度GSE處理下高粱蚜的產仔數 Fig.1 The litter size of sorghum aphid treated withdifferent concentrations of GSE

2.2 GSE對高粱蚜蛻皮數的影響

如圖2所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE飼喂高粱蚜成蚜5d內，其蛻皮數相比對照(CK)呈下降趨勢，且隨著GSE濃度的升高，對高粱蚜蛻皮數的抑制作用越強，3種濃度飼喂與CK的蛻皮數相比均有顯著差異(P<0.05)。飼喂1d時，3種濃度GSE下高粱蚜的蛻皮數相比CK不顯著。飼喂3d時，CK處理下的高粱蚜蛻皮數為10.33個，顯著高于3種濃度GSE處理下的蛻皮數，而15mg/mL的GSE處理下的高粱蚜蛻皮數最少，相比CK下降了83.83%，也顯著低于其他2種濃度下的蛻皮數。飼喂5d時，5mg/mL和10mg/mL GSE處理下的高粱蚜蛻皮數均顯著低于CK，且兩者之間沒有顯著差異，分別為10.33個和12.33個，而15mg/mL GSE處理下的高粱蚜蛻皮數最少，相比CK蛻皮數下降了93.81%。由此表明，GSE處理對高粱蚜的蛻皮數有抑制作用，且隨著時間的延長，3種濃度對高粱蚜蛻皮數相比CK仍有顯著抑制效果，15mg/mL GSE處理下對高粱蚜蛻皮數的抑制效果最強。

圖2 不同濃度GSE處理下高粱蚜的蛻皮數Fig.2 The molting of sorghum aphid treated withdifferent concentrations of GSE

2.3 GSE對高粱蚜體重的影響

如圖3所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE飼喂高粱蚜成蚜5d內，其體重相比對照(CK)呈下降趨勢，且隨GSE濃度的升高，對高粱蚜體重的增長抑制作用越強，3種濃度飼喂與CK的高粱蚜體重相比均有顯著差異(P<0.05)。在飼喂1d時，15mg/mL GSE處理下的高粱蚜體重顯著低于CK，僅有5.07mg，相比CK體重下降了13.63%，而其他2種濃度處理下高粱蚜的體重分別與CK相比無顯著差異。飼喂3d時，10mg/mL GSE處理下的高粱蚜體重顯著低于CK，但高于15mg/mL GSE處理下的高粱蚜體重，且5mg/mL和10mg/mL GSE處理下的高粱蚜體重無顯著差異，分別為6.73mg和7.27mg。飼喂5d時，15mg/mL GSE處理下的高粱蚜體重最低，相比CK體重下降了32.32%，但與10mg/mL GSE處理下的高粱蚜體重之間無顯著差異。由此表明，GSE會抑制高粱蚜體重的增長，且隨著時間的延長，3種濃度對高粱蚜體重增長相比CK仍有顯著抑制效果，10mg/mL和15mg/mL濃度處理對高粱蚜體重的抑制效果最強。

圖3 不同濃度GSE處理下高粱蚜的體重Fig.3 The weight of sorghum aphid treated withdifferent concentrations of GSE

2.4 GSE對高粱蚜若蚜死亡率的影響

如表1所示，在利用5、10、15mg/mL的GSE飼喂高粱蚜若蚜5d內，其死亡率相比對照(CK)逐漸增加，且隨著GSE濃度的升高，高粱蚜若蚜的死亡率越高，3種濃度飼喂與CK的高粱蚜死亡率相比均有顯著差異(P<0.05)。飼喂1d時，10mg/mL GSE處理下的若蚜死亡率與15mg/mL GSE的處理無顯著差異，但顯著高于CK處理和5mg/mL GSE處理下的若蚜死亡率。飼喂3d時，3種濃度處理下若蚜死亡率之間存在顯著差異，且均高于CK，分別達到了93.33%、72.22%和35.56%。飼喂5d時，15mg/mL GSE處理下高粱蚜的死亡率最高，達到95.56%，而CK處理下的死亡率僅為20.00%。經式(2)校正后，飼喂1d時，5mg/mL GSE的若蚜死亡率與CK相比無顯著差異，10mg/mL和15mg/mL GSE處理下若蚜死亡率顯著高于CK，而飼喂3d和5d時，3種濃度處理下對高粱蚜的死亡率均顯著高于對照。由此表明，GSE會增加高粱蚜若蚜的死亡率，且隨著時間的延長，3種GSE處理對高粱蚜若蚜死亡率相比CK仍有顯著升高，15mg/mL GSE對高粱蚜若蚜的死亡率和校正死亡率均為最高。

表1 不同濃度GSE處理下高粱蚜若蚜的死亡率Table 1 Mortality of nymph aphids treated with different concentrations of GSE

2.5 GSE對高粱蚜體內SOD、POD和AChE活性的影響

如圖4所示，在15mg/mL的GSE飼喂5d內，對高粱蚜體內SOD、POD和AChE的活性相比對照(CK)均有顯著差異(P<0.05)。由圖4(a)可知，GSE可以顯著激活5d內的高粱蚜SOD活性，但隨著時間的延長SOD活性呈逐漸下降的趨勢。在飼喂1d時，處理組的SOD活性最強，為1.31U/mg。在3d時處理組SOD活性相比CK差異最大，相比CK活性增加23.85%；在5d時處理組SOD活性相比CK差異最小，相比CK活性增加14.29%。由圖4(b)可知，在飼喂1d時，15mg/mL的GSE可以顯著激活高粱蚜體內POD活性，活性增加20.00%。隨著時間的延長，處理組的POD活性有明顯的下降，且在3d時處理組的POD活性相比CK無顯著差異，5d時處理組的POD活性顯著低于CK，活性下降了43.48%，說明處理后期高粱蚜體內POD活性受到抑制。如圖4(c)所示，GSE可以顯著抑制5d內的高粱蚜AChE活性，且隨著時間的延長，處理組和CK的AChE活性均呈現先上升后下降的趨勢。飼喂1d時，GSE對高粱蚜體內AChE活性抑制效果最強，活性下降了96.90%。飼喂3d和5d時，高粱蚜體內AChE活性均顯著低于CK。

圖4 GSE處理下高粱蚜體內SOD、POD和AChE活性Fig.4 SOD，POD and AChE activities in sorghum aphids treated with GSE

3 討論

本研究結果顯示，生姜莖葉提取物(GSE)對高粱蚜的生長發(fā)育有抑制作用并能致其若蚜死亡。試驗發(fā)現，GSE可以顯著抑制高粱蚜的產仔，且在5d時，15mg/mL的GSE飼喂下高粱蚜的產仔數相比CK下降了58.58%。類似地，TAJDAR等[17]研究發(fā)現薄荷提取物能顯著抑制桃果實蠅的產卵，楊振德等[18]研究發(fā)現苦豆子中的生物堿也能顯著抑制柳藍葉甲的產卵。本研究結果表明GSE中有可能含有抑制高粱蚜產仔的特有活性成分，但其成分有待進一步鑒定。TOYOFUKU等[19]研究發(fā)現植物來源的葫蘆素B可以顯著抑制黑腹果蠅體內蛻皮激素的生物合成，進而抑制幼蟲蛻皮直至死亡。本研究結果顯示，GSE能顯著抑制高粱蚜的蛻皮，且在5d時，15mg/mL的GSE飼喂下高粱蚜蛻皮數相比CK下降了83.83%，說明GSE中也可能具有抑制高粱蚜蛻皮激素合成的物質。本研究也發(fā)現GSE處理下高粱蚜的體重顯著低于對照，且15mg/mL的GSE飼喂5d時，體重相比對照下降了32.32%。類似地，張艷等[20]研究發(fā)現，薰衣草精油處理下斜紋夜蛾幼蟲體重顯著低于對照，且其對斜紋夜蛾幼蟲有胃毒作用和拒食作用，嚴重抑制其生長發(fā)育，田萬里等[21]研究也發(fā)現，狹葉菖蒲乙醇提取物能導致棉鈴蟲幼蟲體重增加量減少，且其對棉鈴蟲幼蟲有胃毒作用和拒食作用，從而生長抑制率升高。這些結果表明，植物提取物中可能具有對生物有害或有拒食作用的物質，影響害蟲的生長發(fā)育。因此，GSE中也可能含有對高粱蚜產生胃毒作用或拒食作用的成分，從而影響高粱蚜發(fā)育。本研究發(fā)現，GSE處理下可顯著增加高粱蚜若蚜的死亡率。類似地，MERIAM等[22]發(fā)現棚架藤甲醇提取物會顯著提高飛蝗若蟲的死亡率，王諄靜等[23]發(fā)現八角茴香浸提液對白背飛虱有較好的殺蟲活性。這些結果也暗示GSE中含有對高粱蚜若蚜產生毒性的物質，引起了若蚜的死亡。

害蟲耐藥性是目前研究害蟲防治的熱點之一，而昆蟲體內相關防御酶是研究害蟲耐藥性的重要因素[24,25]。SOD和POD是昆蟲體內重要的抗氧化酶，當昆蟲受到有毒物質脅迫時，會激活昆蟲體內SOD和POD的活性，將其體內的超氧自由基維持在較低水平以防止自由基毒性[26]。本研究發(fā)現GSE對高粱蚜具有殺蟲活性，15mg/mL GSE處理下高粱蚜體內SOD活性顯著高于對照。類似地，程作慧等[27]研究發(fā)現在迷迭香精油處理下可以顯著激活朱砂葉螨體內SOD和POD的活性；CZERNIEWICZ等[28]研究發(fā)現香棉菊和孔雀草精油處理誘導了桃蚜和禾谷縊管蚜體內ROS的產生，導致2種蚜蟲體內SOD活性顯著升高；姬蘭柱等[29]研究發(fā)現細辛精油分離出的餾分顯著提高玉米螟和黏蟲體內的SOD活性。這些結果表明高粱蚜在15mg/mL GSE處理下可以激活體內SOD的活性，應對氧化損傷。然而，本研究也發(fā)現15mg/mL GSE處理下高粱蚜體內POD活性表現出了先激活后抑制。這與宋程飛等[30]研究發(fā)現綠薄荷莖葉提取物對小菜蛾體內POD活性表現為先上升后下降，馬新耀等[31]研究發(fā)現藿香精油對朱砂葉螨體內POD活性表現為先激活后抑制的結果相似。產生這種現象的原因可能是植物提取物處理初期擾亂了害蟲體內活性氧的平衡，致使體內自由基的積累，通過激活保護酶活性來清除自由基，緩解蟲體損傷，但隨著處理時間延長，害蟲體內有毒物質增加，自由基迅速積累，從而導致部分防御酶開始受到抑制，對蟲體的毒害作用增強[32]。AChE是昆蟲體內的解毒酶，也是神經系統中的一種重要水解酶，可以催化神經遞質中膽堿的水解來阻止神經沖動[33]。與SOD和POD的活性相比，本研究發(fā)現15mg/mL GSE處理下高粱蚜體內AChE活性受到顯著的抑制。類似地，ZHOU等研究發(fā)現[34]八角果實提取物可以抑制桃蚜體內AChE的活性，導致桃蚜神經系統紊亂，蟲體死亡。CARLOS等[35]研究發(fā)現灰白銀膠菊提取物可以顯著抑制草地貪夜蛾體內AChE活性，導致其蟲體死亡，ELSAYED等[36]研究發(fā)現茴芹油也能顯著抑制二斑葉螨體內AChE活性。這些研究表明植物提取物中可能含有抑制害蟲體內AChE活性的物質，這些物質會導致害蟲神經系統紊亂，直至蟲體死亡。上述結果表明，GSE中可能含有引起高粱蚜防御機制的活性成分，這些成分是導致高粱蚜死亡的重要原因，但其主要功能成分還不明晰?？梢娧芯坷ハx防御酶對植物源殺蟲劑的作用機理和昆蟲的抗藥性具有重要意義。

本研究結果表明，GSE有抑制高粱蚜的正常發(fā)育和繁殖的作用，也會導致高粱蚜的死亡，這可能是通過影響高粱蚜體內的防御酶活性造成的。本研究探討了GSE對高粱蚜的飼喂毒性和蟲體防御酶應答機制，但GSE作用于蚜蟲的主要活性成分及其殺蟲成分的作用機理尚不清楚，還需要進一步研究。