滇南美登木總?cè)铺崛」に囇芯?/h1>
2022-10-29 09:56:36方振峰楊園房輝楊光
江漢大學學報(自然科學版) 2022年5期
方振峰，楊園，房輝，楊光
（江漢大學醫(yī)學院藥學系，湖北 武漢 430056）
美登木屬植物全世界約有300種，主要產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，以南美洲分布最多。中國約有20種和1個變種，主要分布在云南省、長江以南各省區(qū)，西藏自治區(qū)也有分布，多生長于山谷山坡或水邊的樹林中［1］。自從美國科學家從齒葉美登木（Maytenus serrata）中分離得到高等植物中第一個大環(huán)內(nèi)酯類天然抗腫瘤活性成分［2］，美登木屬植物受到了人們的廣泛關(guān)注。國內(nèi)學者陸續(xù)對云南美登木［3-8］、密花美登木［9-12］、刺茶美登木［13］、廣西美登木［14］、海南美登木［15-16］、厚葉美登木［17］、滇南美登木［18-19］等多種美登木屬植物及其代謝產(chǎn)物的化學成分和藥理活性進行研究。但美登木屬植物中生物堿類成分含量較低，三萜類成分是其主要化學成分。三萜類化合物表現(xiàn)出較強的抗腫瘤、抗炎、抗菌等活性［8］。
滇南美登木（Maytenus austroyunnanensisS.J.Pei et Y.H.Li）為衛(wèi)矛科（Celastraceae）美登木屬（Maytenus Molina）植物，主要產(chǎn)于云南的景洪、勐養(yǎng)、勐罕、雙江、思茅、耿馬等地［20］。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前對該種植物的研究較少，三萜類成分為其主要化學成分，約有14種，其中部分化合物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性［18-19］。為了更好地開發(fā)利用該種植物，筆者對滇南美登木中總?cè)频奶崛」に囘M行了研究，以齊墩果酸為標準品，總?cè)祁惡繛橹笜耍?%香草醛-冰醋酸、高氯酸為顯色劑，采用紫外分光光度法分別考察了提取方法、提取時間、料液比、提取次數(shù)、超聲功率5種因素對滇南美登木總?cè)祁惓煞痔崛〉挠绊懀Y選出最優(yōu)提取工藝，以期對滇南美登木化學成分及藥理活性的深入研究提供一定的實驗依據(jù)。
1 材料
1.1 儀器設(shè)備
ME104E電子天平，精度：0.0001 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；島津AUX120D分析天平（精度：0.01 mg，島津國際貿(mào)易上海有限公司）；UVmini-1240紫外可見分光光度計（島津儀器（蘇州）有限公司））；超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（上海秋佐科學儀器有限公司）；ST-510Y 1000 g高速搖擺粉碎機（浙江瑞安市塞特機電有限公司）。
1.2 試劑
甲醇、冰醋酸、高氯酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；齊墩果酸分析對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號308D027，CAS：508-01-01，HPLC≥98.0%）。
1.3 藥材
滇南美登木藥材產(chǎn)自云南省西雙版納，經(jīng)江漢大學醫(yī)學院藥學系張濤教授鑒定為衛(wèi)矛科美登木屬植物滇南美登木Maytenus austroyunnanensisS.J.Pei et Y.H.Li的莖和葉。
2 方法和結(jié)果
2.1 含量測定
2.1.1 溶液的制備1）對照品溶液的制備
精密稱取7.96 mg齊墩果酸對照品，置于10 mL容量瓶中，加適量的甲醇，超聲溶解，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.7960 mg/mL對照品溶液。
2）供試品溶液的制備
取干燥后的滇南美登木藥材，粉碎，過60目篩，精密稱取1.5 g粉末，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL，超聲提取1 h，過濾，回收溶劑，浸膏用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，甲醇定容到刻度，過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。
3）顯色溶液的制備
精密量取齊墩果酸對照品溶液、供試品溶液和蒸餾水各0.1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，分別加入0.3%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，搖勻，再加入高氯酸溶液1 mL，搖勻，置于60℃水浴中加熱25 min，冷卻，再加入冰醋酸1 mL，搖勻，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品顯色溶液、供試品顯色溶液和空白對照顯色溶液。
2.1.2 最大吸收波長的測定取適量“2.1.1”項下對照品顯色溶液和供試品顯色溶液，照紫外-可見分光光度法，在200～800 nm掃描，結(jié)果二者在553 nm處均有最大吸收，故選553 nm為測定波長。
2.1.3 標準曲線的繪制分別精密量取上述齊墩果酸對照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，按“2.1.1”項“顯色溶液的制備”同法操作。以空白顯色溶液為參比，在553 nm處測定吸光度，以齊墩果酸濃度（C，mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程A=0.0165C+0.1791（r=0.9999）。表明齊墩果酸在3.98～27.86 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.1.4 檢測限和定量限將空白顯色溶液連續(xù)測定6次，進行時間掃描，記錄吸光度，得到平均吸光度值，即噪音。取對照品溶液按“2.1.1溶液的制備”項下“顯色溶液的制備”同法操作，稀釋成不同濃度進行吸光度測定，扣除空白，所得吸光度值為噪音值3倍時的濃度為檢測限，得到檢測限為3.98 mg/L。所得吸光度值為噪音值10倍時的濃度為定量限，得到檢測限為12.56 mg/L。
2.1.5 精密度試驗日內(nèi)精密度試驗：精密吸取對照品溶液0.5 mL，置于100 mL容量瓶中，按“2.1.1溶液的制備”項下“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定6次，記錄吸光度。結(jié)果齊墩果酸吸光度的RSD為0.67%(n=6)，表明儀器的日內(nèi)精密度良好。
日間精密度試驗：取對照品溶液0.5 mL，按“2.1.1溶液的制備”項下“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定，連續(xù)3 d，每天2次，記錄吸光度。結(jié)果齊墩果酸吸光度的RSD為1.88%（n=6），表明儀器的日間精密度良好。
2.1.6 重復性試驗稱取同一批滇南美登木藥材粉末6份，每份約1.5 g，精密稱定，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定，記錄吸光度。結(jié)果總?cè)莆舛鹊腞SD為1.04%，表明方法重現(xiàn)性良好。
2.1.7 穩(wěn)定性試驗取滇南美登木藥材粉末1.5 g，精密稱定，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，于0、0.5、1、2、6、12、24 h在最大吸收波長處測定，記錄吸光度。測得吸光度RSD為1.49%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.1.8 加樣回收試驗取樣品藥材粉末約0.5 g，共9份，精密稱定，分別按樣品含量的80%、100%和120%加入標準品，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定，記錄吸光度，計算平均加樣回收率及RSD，結(jié)果見表1。
表1 加樣回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of sample adding recovery experiment
2.2 單因素實驗
2.2.1 提取方法考察取滇南美登木藥材粉末2份，每份1.5 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入甲醇45 mL，分別采用超聲和加熱回流兩種方法提取40 min，過濾，回收溶劑，浸膏用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，甲醇定容，過濾，取續(xù)濾液0.1 mL，按“2.1.1”項下“顯色溶液的制備”同法操作。在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪俊Ｃ糠N方法平行測定3次。實驗結(jié)果表明，超聲提取時總?cè)坪繛椋?2.37±0.27）mg/g，而加熱回流法提取時總?cè)坪繛椋?6.84±1.43）mg/g。利用SPSS22.0軟件進行ANOVA單因素分析，表明超聲提取所得總?cè)坪亢图訜峄亓魈崛∷每側(cè)坪吭诮y(tǒng)計學上存在非常顯著性差異（P=0.003＜0.01），可能由于超聲波可產(chǎn)生強烈的空化、機械粉碎以及熱作用，使三萜物質(zhì)更好溶于溶劑中，并且超聲提取法經(jīng)濟成本更低、操作更加方便，因此，本實驗提取方法采取超聲提取。
2.2.2 料液比的考察 取滇南美登木藥材粉末5份，每份約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入甲醇溶液，甲醇體積按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50計算，分別按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪俊Ｆ叫袦y定3次，結(jié)果見表2。同時，在測得三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了料液比對滇南美登木總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表3。
從表2中可以看出，滇南美登木總?cè)坪肯入S著料液比的增大而增大，當料液比為1∶30時，總?cè)瞥煞趾孔罡邽椋?2.54±0.54）mg/g；1∶20時，次之，為（21.96±0.57）mg/g，可能是因為隨著料液比增大，溶劑與藥材接觸能更充分，使更多的有效成分溶解出來。但當料液比達到1∶40時，其含量驟然下降，隨后變化不大。另外，從表3中可知，料液比1∶20、1∶30時所得含量與1∶10、1∶40、1∶50時所得含量之間分別存在非常顯著性或極其顯著性差異，但1∶10、1∶40、1∶50時所得含量之間以及1∶20、1∶30時所得含量之間進行兩兩比較時均無明顯統(tǒng)計學上差異。因此，綜合含量以及成本考慮，選取料液比1∶20為滇南美登木總?cè)铺崛r最佳料液比。
表2 不同液料比對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.2 Effects of different liquid material ratios on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表3 不同料液比組之間總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.3 Multiple comparison results of total triterpene content between different material liquid ratio groups
2.2.3 提取時間的考察稱取滇南美登木藥材粉末5份，每份約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液30 mL，分別超聲提取30、60、90、120 min，按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪俊Ｆ叫袦y定3次，結(jié)果見表4。同時，在測得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了提取時間對總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表5。
從表4中可以看出，滇南美登木總?cè)坪吭谔崛r間為60 min時最高，為（22.72±0.68）mg/g，隨后隨著時間的增加，含量有所下降，可能是因為隨著時間增加，發(fā)生了副反應(yīng)導致總?cè)频寐氏陆?。另外，從?中可知，提取時間為60 min時所得三萜含量與其他提取時間所得三萜含量之間進行兩兩比較時，在統(tǒng)計學上存在顯著、非常顯著或極其顯著性的差異。因此，選取提取時間60 min為滇南美登木總?cè)铺崛r最佳提取時間。
表4 不同提取時間對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.4 Effects of different extraction time on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表5 不同提取時間組之間總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.5 Multiple comparison results of total triterpene content between different extraction time groups
2.2.4 提取次數(shù)的考察稱取滇南美登木藥材粉末3份，每份約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液30 mL，超聲提取60 min，分別超聲提取1、2、3次，按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪?。平行測定3次，結(jié)果見表6。同時，在測得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了提取次數(shù)對總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表7。
從表6中可以看出，滇南美登木總?cè)坪吭谔崛〈螖?shù)為1時最高，為（22.90±0.58）mg/g，隨后總?cè)频寐氏陆怠谋?中可知，提取1次、2次和3次時所得三萜含量之間進行ANOVA單因素LSD多重比較時，在統(tǒng)計學上表現(xiàn)出無明顯差異（P＞0.05）。因此，從節(jié)約時間以及溶劑成本方面考慮，選取提取次數(shù)為1次作為滇南美登木總?cè)铺崛r最佳提取次數(shù)。
表6 不同提取次數(shù)對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.6 Effects of different extraction times on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表7 不同提取次數(shù)總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.7 Multiple comparison results of total triterpene content between different extraction times groups
2.2.5 超聲功率的考察取滇南美登木藥材粉末5份，每份1.5 g，精密稱定，并置于具塞錐形瓶中，分別設(shè)定超聲功率為300、350、400、450、500 W，按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪?。平行測定3次，結(jié)果見表8。同時，在測得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了超聲功率對總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表9。
從表8中可以看出，在超聲功率為450 W時提取滇南美登木總?cè)坪孔罡?，為?3.27±0.66）mg/g。同時，從表9中可知，在超聲功率為450 W時所得三萜含量與其他4種功率提取所得總?cè)频暮吭诮y(tǒng)計學上存在顯著性差異（P＜0.05）或非常顯著性差異（P＜0.01），而超聲功率為300、350、400以及500 W時提取滇南美登木總?cè)坪恐g在統(tǒng)計學上無明顯差異（P＞0.05）。因此，選取超聲功率為450 W作為提取滇南美登木總?cè)茣r最佳超聲功率。
表8 不同超聲功率對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.8 Effects of different ultrasonic power on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表9 不同超聲功率總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.9 Multiple comparison results of total triterpene content between different ultrasonic power groups
2.3 驗證試驗
取滇南美登木藥材粉末3份，每份1.5 g，精密稱取，在最優(yōu)提取工藝條件下，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算滇南美登木中總?cè)坪俊＝Y(jié)果滇南美登木中總?cè)破骄繛?3.99 mg/g（n=3，RSD=0.69%），表明該提取工藝合理。
3 結(jié)論
美登木屬植物具有良好的抗腫瘤活性，其中滇南美登木為我國特有物種，其主要成分三萜類具有良好的抗腫瘤活性，但文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前人們對其研究較少。本實驗建立了滇南美登木中總?cè)祁惡康臏y定方法，并通過單因素實驗考察了提取方法、提取時間、料液比、提取次數(shù)、超聲功率5種因素對總?cè)坪康挠绊懀肧PSS22.0軟件對單因素實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA單因素統(tǒng)計分析和兩兩間多重比較LSD檢驗，篩選出最優(yōu)滇南美登木總?cè)频奶崛」に嚄l件：超聲提取，料液比（g/mL）為1∶20，超聲功率為450 W，提取1次，時間為60 min，所得到滇南美登木三萜含量最高，為23.99 mg/g。該方法提取率高、操作簡單、方法可靠、實驗數(shù)據(jù)準確，為滇南美登木化學成分及藥理活性的深入研究提供一定的實驗依據(jù)。
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2）供試品溶液的制備
取干燥后的滇南美登木藥材，粉碎，過60目篩，精密稱取1.5 g粉末，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL，超聲提取1 h，過濾，回收溶劑，浸膏用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，甲醇定容到刻度，過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。
3）顯色溶液的制備
精密量取齊墩果酸對照品溶液、供試品溶液和蒸餾水各0.1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，分別加入0.3%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，搖勻，再加入高氯酸溶液1 mL，搖勻，置于60℃水浴中加熱25 min，冷卻，再加入冰醋酸1 mL，搖勻，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品顯色溶液、供試品顯色溶液和空白對照顯色溶液。
2.1.2 最大吸收波長的測定取適量“2.1.1”項下對照品顯色溶液和供試品顯色溶液，照紫外-可見分光光度法，在200～800 nm掃描，結(jié)果二者在553 nm處均有最大吸收，故選553 nm為測定波長。
2.1.3 標準曲線的繪制分別精密量取上述齊墩果酸對照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，按“2.1.1”項“顯色溶液的制備”同法操作。以空白顯色溶液為參比，在553 nm處測定吸光度，以齊墩果酸濃度（C，mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程A=0.0165C+0.1791（r=0.9999）。表明齊墩果酸在3.98～27.86 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.1.4 檢測限和定量限將空白顯色溶液連續(xù)測定6次，進行時間掃描，記錄吸光度，得到平均吸光度值，即噪音。取對照品溶液按“2.1.1溶液的制備”項下“顯色溶液的制備”同法操作，稀釋成不同濃度進行吸光度測定，扣除空白，所得吸光度值為噪音值3倍時的濃度為檢測限，得到檢測限為3.98 mg/L。所得吸光度值為噪音值10倍時的濃度為定量限，得到檢測限為12.56 mg/L。
2.1.5 精密度試驗日內(nèi)精密度試驗：精密吸取對照品溶液0.5 mL，置于100 mL容量瓶中，按“2.1.1溶液的制備”項下“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定6次，記錄吸光度。結(jié)果齊墩果酸吸光度的RSD為0.67%(n=6)，表明儀器的日內(nèi)精密度良好。
日間精密度試驗：取對照品溶液0.5 mL，按“2.1.1溶液的制備”項下“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定，連續(xù)3 d，每天2次，記錄吸光度。結(jié)果齊墩果酸吸光度的RSD為1.88%（n=6），表明儀器的日間精密度良好。
2.1.6 重復性試驗稱取同一批滇南美登木藥材粉末6份，每份約1.5 g，精密稱定，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定，記錄吸光度。結(jié)果總?cè)莆舛鹊腞SD為1.04%，表明方法重現(xiàn)性良好。
2.1.7 穩(wěn)定性試驗取滇南美登木藥材粉末1.5 g，精密稱定，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，于0、0.5、1、2、6、12、24 h在最大吸收波長處測定，記錄吸光度。測得吸光度RSD為1.49%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.1.8 加樣回收試驗取樣品藥材粉末約0.5 g，共9份，精密稱定，分別按樣品含量的80%、100%和120%加入標準品，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長處測定，記錄吸光度，計算平均加樣回收率及RSD，結(jié)果見表1。
表1 加樣回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of sample adding recovery experiment
2.2 單因素實驗
2.2.1 提取方法考察取滇南美登木藥材粉末2份，每份1.5 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入甲醇45 mL，分別采用超聲和加熱回流兩種方法提取40 min，過濾，回收溶劑，浸膏用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，甲醇定容，過濾，取續(xù)濾液0.1 mL，按“2.1.1”項下“顯色溶液的制備”同法操作。在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪俊Ｃ糠N方法平行測定3次。實驗結(jié)果表明，超聲提取時總?cè)坪繛椋?2.37±0.27）mg/g，而加熱回流法提取時總?cè)坪繛椋?6.84±1.43）mg/g。利用SPSS22.0軟件進行ANOVA單因素分析，表明超聲提取所得總?cè)坪亢图訜峄亓魈崛∷每側(cè)坪吭诮y(tǒng)計學上存在非常顯著性差異（P=0.003＜0.01），可能由于超聲波可產(chǎn)生強烈的空化、機械粉碎以及熱作用，使三萜物質(zhì)更好溶于溶劑中，并且超聲提取法經(jīng)濟成本更低、操作更加方便，因此，本實驗提取方法采取超聲提取。
2.2.2 料液比的考察 取滇南美登木藥材粉末5份，每份約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入甲醇溶液，甲醇體積按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50計算，分別按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪俊Ｆ叫袦y定3次，結(jié)果見表2。同時，在測得三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了料液比對滇南美登木總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表3。
從表2中可以看出，滇南美登木總?cè)坪肯入S著料液比的增大而增大，當料液比為1∶30時，總?cè)瞥煞趾孔罡邽椋?2.54±0.54）mg/g；1∶20時，次之，為（21.96±0.57）mg/g，可能是因為隨著料液比增大，溶劑與藥材接觸能更充分，使更多的有效成分溶解出來。但當料液比達到1∶40時，其含量驟然下降，隨后變化不大。另外，從表3中可知，料液比1∶20、1∶30時所得含量與1∶10、1∶40、1∶50時所得含量之間分別存在非常顯著性或極其顯著性差異，但1∶10、1∶40、1∶50時所得含量之間以及1∶20、1∶30時所得含量之間進行兩兩比較時均無明顯統(tǒng)計學上差異。因此，綜合含量以及成本考慮，選取料液比1∶20為滇南美登木總?cè)铺崛r最佳料液比。
表2 不同液料比對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.2 Effects of different liquid material ratios on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表3 不同料液比組之間總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.3 Multiple comparison results of total triterpene content between different material liquid ratio groups
2.2.3 提取時間的考察稱取滇南美登木藥材粉末5份，每份約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液30 mL，分別超聲提取30、60、90、120 min，按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪俊Ｆ叫袦y定3次，結(jié)果見表4。同時，在測得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了提取時間對總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表5。
從表4中可以看出，滇南美登木總?cè)坪吭谔崛r間為60 min時最高，為（22.72±0.68）mg/g，隨后隨著時間的增加，含量有所下降，可能是因為隨著時間增加，發(fā)生了副反應(yīng)導致總?cè)频寐氏陆?。另外，從?中可知，提取時間為60 min時所得三萜含量與其他提取時間所得三萜含量之間進行兩兩比較時，在統(tǒng)計學上存在顯著、非常顯著或極其顯著性的差異。因此，選取提取時間60 min為滇南美登木總?cè)铺崛r最佳提取時間。
表4 不同提取時間對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.4 Effects of different extraction time on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表5 不同提取時間組之間總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.5 Multiple comparison results of total triterpene content between different extraction time groups
2.2.4 提取次數(shù)的考察稱取滇南美登木藥材粉末3份，每份約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液30 mL，超聲提取60 min，分別超聲提取1、2、3次，按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪?。平行測定3次，結(jié)果見表6。同時，在測得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了提取次數(shù)對總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表7。
從表6中可以看出，滇南美登木總?cè)坪吭谔崛〈螖?shù)為1時最高，為（22.90±0.58）mg/g，隨后總?cè)频寐氏陆怠谋?中可知，提取1次、2次和3次時所得三萜含量之間進行ANOVA單因素LSD多重比較時，在統(tǒng)計學上表現(xiàn)出無明顯差異（P＞0.05）。因此，從節(jié)約時間以及溶劑成本方面考慮，選取提取次數(shù)為1次作為滇南美登木總?cè)铺崛r最佳提取次數(shù)。
表6 不同提取次數(shù)對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.6 Effects of different extraction times on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表7 不同提取次數(shù)總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.7 Multiple comparison results of total triterpene content between different extraction times groups
2.2.5 超聲功率的考察取滇南美登木藥材粉末5份，每份1.5 g，精密稱定，并置于具塞錐形瓶中，分別設(shè)定超聲功率為300、350、400、450、500 W，按“2.1.1”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶劑的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算樣品中總?cè)坪?。平行測定3次，結(jié)果見表8。同時，在測得的三萜含量的數(shù)值滿足方差齊性的前提條件（P＞0.05）下，進行了超聲功率對總?cè)坪坑绊懙腁NOVA單因素兩兩間多重比較LSD檢驗，結(jié)果見表9。
從表8中可以看出，在超聲功率為450 W時提取滇南美登木總?cè)坪孔罡?，為?3.27±0.66）mg/g。同時，從表9中可知，在超聲功率為450 W時所得三萜含量與其他4種功率提取所得總?cè)频暮吭诮y(tǒng)計學上存在顯著性差異（P＜0.05）或非常顯著性差異（P＜0.01），而超聲功率為300、350、400以及500 W時提取滇南美登木總?cè)坪恐g在統(tǒng)計學上無明顯差異（P＞0.05）。因此，選取超聲功率為450 W作為提取滇南美登木總?cè)茣r最佳超聲功率。
表8 不同超聲功率對滇南美登木中總?cè)坪康挠绊慣ab.8 Effects of different ultrasonic power on the content of total triterpenes from Maytenus austroyunnanensis
表9 不同超聲功率總?cè)坪縇SD事后多重比較結(jié)果Tab.9 Multiple comparison results of total triterpene content between different ultrasonic power groups
2.3 驗證試驗
取滇南美登木藥材粉末3份，每份1.5 g，精密稱取，在最優(yōu)提取工藝條件下，按“2.1.1溶液的制備”項下“供試品溶液的制備”和“顯色溶液的制備”同法操作，在最大吸收波長553 nm處測定吸光度，計算滇南美登木中總?cè)坪俊＝Y(jié)果滇南美登木中總?cè)破骄繛?3.99 mg/g（n=3，RSD=0.69%），表明該提取工藝合理。
3 結(jié)論
美登木屬植物具有良好的抗腫瘤活性，其中滇南美登木為我國特有物種，其主要成分三萜類具有良好的抗腫瘤活性，但文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前人們對其研究較少。本實驗建立了滇南美登木中總?cè)祁惡康臏y定方法，并通過單因素實驗考察了提取方法、提取時間、料液比、提取次數(shù)、超聲功率5種因素對總?cè)坪康挠绊懀肧PSS22.0軟件對單因素實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA單因素統(tǒng)計分析和兩兩間多重比較LSD檢驗，篩選出最優(yōu)滇南美登木總?cè)频奶崛」に嚄l件：超聲提取，料液比（g/mL）為1∶20，超聲功率為450 W，提取1次，時間為60 min，所得到滇南美登木三萜含量最高，為23.99 mg/g。該方法提取率高、操作簡單、方法可靠、實驗數(shù)據(jù)準確，為滇南美登木化學成分及藥理活性的深入研究提供一定的實驗依據(jù)。
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