金黃疏肝應(yīng)激散對靶動物草魚的安全性試驗

肖飛

（武漢華揚動物藥業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430205）

魚類抗應(yīng)激能力是衡量魚類健康水平的重要標(biāo)志之一，而魚類健康水平是依賴于機體諸器官的正常運轉(zhuǎn)，其中肝膽功能與魚體代謝密切相關(guān)。開發(fā)金黃疏肝應(yīng)激散的目的是通過飼料中添加適量的藥物，保護(hù)魚體肝臟及解除機體內(nèi)毒性物質(zhì)的積累，促進(jìn)機體正常代謝，以提高其抗應(yīng)激能力。

該中藥制劑對非病原性疾病的癥狀治療針對性較強，主藥郁金具行氣化瘀、疏肝利膽、增強肝酶活性、降血脂、抗氧化等作用；姜黃作為平肝藥，具改善肝膽實質(zhì)細(xì)胞病損、利膽促代謝功能；輔藥刺五加益氣安神、抗應(yīng)激、改善內(nèi)分泌，具適應(yīng)原樣作用和對病理過程起調(diào)節(jié)作用。

為證明金黃疏肝應(yīng)激散在推薦使用條件下對靶動物的安全性，了解草魚與金黃疏肝應(yīng)激散可能出現(xiàn)毒性有關(guān)的臨床反應(yīng)特征，確定金黃疏肝應(yīng)激散對靶動物的安全范圍，指導(dǎo)臨床用藥，有必要評價金黃疏肝應(yīng)激散對靶動物草魚的安全性。為此，本研究將從增重率［1，2］、血液學(xué)［3］和組織學(xué)等3方面來評價其安全性。

1 材料與方法

1.1 受試藥品

金黃疏肝應(yīng)激散（主要成分：郁金、姜黃、刺五加，批號為20200125），由武漢華揚動物藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

健康草 魚360尾，尾重50?70 g，試驗 前，用50 mg/L高錳酸鉀對水族箱、試驗用具和水體進(jìn)行徹底消毒，然后再徹底沖洗。先將受試魚在室內(nèi)2個大型水族箱（每個水箱水量1.5 m3）中暫養(yǎng)2周左右，水溫為（28±2）℃，pH 6.8?7.4，持續(xù)充氧，溶氧量5.0? 8.0 mg/L。保持恒定的水流，每天換水率約為30%，光照周期為12 L∶12 D。馴化期間每日于上午9點左右投喂1次顆粒餌料（其組成及成分見表1），投喂量為魚體重的2%。受試魚暫養(yǎng)后期活動正常，無病，無死亡，暫養(yǎng)結(jié)束后選擇體質(zhì)健壯、無病無傷的個體進(jìn)行分組試驗。試驗箱為圓筒形水箱，水體積約為120 L。

表1日糧組成及營養(yǎng)成分

1.3 試驗方法

暫養(yǎng)后試驗魚禁食24 h后，將試驗魚共分為4組進(jìn)行養(yǎng)殖試驗，分別為對照組和低劑量（L）、中劑量（M）、高劑量（H）試驗組，每組3個重復(fù)箱，每箱30尾魚。藥物組劑量分別為100、300和500 mg/kg體重（推薦劑量為100 mg/kg體重），折算到飼料中添加分別為0.5%、1.5%和2.5%。將粉狀試驗藥物摻入到粉狀飼料中，并加入適量黏合劑，充分拌勻后，自配成顆粒狀飼料，晾干，飼養(yǎng)3周，每周對每組魚進(jìn)行稱重，依此調(diào)整投餌量。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 一般狀況觀察每天對魚的攝食、呼吸、游動及外觀狀況進(jìn)行觀察。若出現(xiàn)明顯中毒癥狀或死亡，對魚進(jìn)行剖檢，觀察臟器的病理變化［4］。養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，禁食24 h，稱量魚體總質(zhì)量，計算各劑量組草魚的增重率。增重率=100%×（末均重－初均重）/初均重。

1.4.2 血液生理生化指標(biāo)隨機撈取15尾魚，用一次性注射器從尾靜脈采血，分裝于普通和加有抗凝劑的EDTA-K2采血管中，分別用于制備血清和全血。由于有的魚個體不夠大，或采血不夠順利，采集的血量有限，部分指標(biāo)為2?3尾魚血樣混合后測定的結(jié)果。

1.4.3 病理組織觀察采血前測定試驗魚的體重。然后，取肝胰臟、腎臟和脾臟［5，6］放入Bouin’s液中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，組織切片機切片，厚度為4?5 μm，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織學(xué)特征。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性檢驗。采用t檢驗比較試驗組與對照組間均增重、血液學(xué)和血液生化學(xué)等各項指標(biāo)的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀表現(xiàn)

與對照組比較，試驗期間各給藥組游動、集群、棲息水層、食性、外觀均無異常變化。此外，各試驗組在3周試驗時間均未出現(xiàn)因病死亡，只有低劑量和高劑量試驗組各1尾跳出魚箱未及時發(fā)現(xiàn)而死。

2.2 各組草魚特定生長率、飼料效率

試驗期間，各組草魚初均重、末均重、平均增長率見表2。與對照組相比，低劑量和中劑量試驗組的平均增重率比對照組有所增加，但差異不顯著（P＞0.05），高劑量試驗組的增長率雖有所下降，但與對照組相比也沒有顯著差異（P＞0.05），表明投喂金黃疏肝應(yīng)激散不影響魚的攝食與生長，而且中低劑量甚至具有一定的促生長作用。

表2 試驗各組草魚的增長率（n=15）

2.3 血液生化指標(biāo)變化

各試驗組草魚血液生理生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表3。投喂常規(guī)劑量的金黃疏肝應(yīng)激散3周對草魚的健康沒有產(chǎn)生影響，肝腎功能和血球蛋白含量都未受影響。與對照組相比，各試驗組血清中總膽固醇含量均有下降，其中低劑量和中劑量試驗組顯著下降（P＜0.05）。此外，低劑量試驗組AST、總膽紅素水平明顯低于對照組。高劑量試驗組的白蛋白含量比對照組有顯著下降（P＜0.05），總蛋白含量也有一定程度下降，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 各組草魚血液生理指標(biāo)情況（n=15）

2.4 金黃疏肝應(yīng)激散對草魚組織病理學(xué)影響

2.4.1 肝臟組織病理變化對照組在試驗過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不大［7，8］，清晰可見肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周排列呈索狀，肝細(xì)胞呈多邊形，邊緣清晰，核清晰可見，基本位于中央，肝細(xì)胞索之間有竇狀隙。金黃疏肝應(yīng)激散不同添加量試驗組的草魚肝臟組織均未發(fā)生明顯病理變化（圖1），與對照組基本相似。

圖1 對照組和試驗組草魚肝臟的組織學(xué)切片

2.4.2 腎臟組織病理變化對照組草魚腎臟組織無明顯病理變化，腎小體頸段由單層立方上皮構(gòu)成，細(xì)胞呈矮棱柱狀，細(xì)胞核為圓形，中位。近曲小管由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞呈高棱柱狀，細(xì)胞核大，基位，多為圓形或橢圓形，細(xì)胞間界限模糊。遠(yuǎn)曲小管由單層立方上皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞呈矮棱柱狀，細(xì)胞核為圓形，中位，細(xì)胞間界限較為清晰。收集管連接腎單位與集合管，管道外有少量結(jié)締組織，細(xì)胞呈立方形，細(xì)胞核中位（圖2）。金黃疏肝應(yīng)激散不同添加量試驗組草魚的肝臟組織均未發(fā)生明顯病理變化。

圖2 對照組和試驗組草魚腎臟的組織學(xué)切片

2.4.3 脾臟組織病理變化對照組腸道黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，紋狀緣發(fā)達(dá)，黏膜層杯狀細(xì)胞較多，黏膜下層較?。▓D3）。金黃疏肝應(yīng)激散不同添加量試驗組草魚脾臟組織均未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。

圖3 對照組和試驗組草魚脾臟的組織學(xué)切片

3 討論與結(jié)論

3.1 金黃疏肝應(yīng)激散對草魚增重率、血液生理指標(biāo)的影響

中草藥作為飼料添加劑在魚類應(yīng)用的研究表明，姜黃和含有姜黃的復(fù)方中草藥能較好地提高魚類的生長性能。本研究發(fā)現(xiàn)采用含有郁金、姜黃和刺五加的中藥復(fù)方制劑金黃疏肝應(yīng)激散進(jìn)行靶動物安全性試驗，連續(xù)飼喂草魚3周，各試驗組均未發(fā)生因疾病而導(dǎo)致的死亡，表明不同劑量的金黃疏肝應(yīng)激散不會影響魚類的存活率，具有潛在的提高草魚生產(chǎn)的趨勢，與相關(guān)研究報道一致［9-12］。

ALT、AST是反映肝細(xì)胞線粒體和胞漿健康狀況的重要轉(zhuǎn)氨酶，通常血液中含量較少。當(dāng)肝臟受損傷時，會引起細(xì)胞通透性增加，轉(zhuǎn)氨酶會轉(zhuǎn)移到血液中。因此，血清中ALT、AST活性的高低可以反映肝功能的健康狀況［13］。本研究中各試驗組血液中的ALT和AST均沒有影響，表明金黃疏肝應(yīng)激散未對草魚造成肝腎損傷。高劑量試驗組的白蛋白含量低于對照組（P＜0.05），而且血紅蛋白和血清總蛋白含量也略低于對照組，可能是由于添加的藥物比例過高，降低了餌料中蛋白質(zhì)含量。試驗組的總膽固醇水平低于空白組，而且低劑量和中劑量試驗組有顯著差異（P＜0.05），說明金黃疏肝應(yīng)激散有改善脂質(zhì)代謝的作用，有利于防治肝膽綜合征。

3.2 金黃疏肝應(yīng)激散對草魚組織病理學(xué)影響

研究表明，姜黃素的小鼠單次給藥最大量為20 g/kg，SD大鼠重復(fù)給藥最大無毒反應(yīng)劑量（NOAEL）為4 g/kg［14］。陳嬌嬌等［15］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對斑馬魚胚胎及幼魚有一定的急性毒性及致畸作用，作用于胚胎和幼魚的最大安全濃度分別為1.86和4.0 μmol/L。本研究中未表現(xiàn)出金黃疏肝應(yīng)激散對草魚的毒性作用，可能與試驗靶動物和劑量有關(guān)。徐道修［16］采用郁金散水煎劑進(jìn)行了最大濃度、最大體積給小鼠一次性灌胃試驗，試驗過程中未發(fā)現(xiàn)小鼠有死亡的現(xiàn)象，表明郁金散水煎劑具有良好用藥安全性。孫蘭等［17］采用小鼠經(jīng)口灌胃給予刺五加口服液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌、雄小鼠經(jīng)口急性毒性MTD均大于24.0 g/kg BW，屬于無毒級；在2.5?10.0 g/kg BW劑量范圍內(nèi)，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗結(jié)果未見異常，屬于陰性，表明刺五加口服液無毒且未顯示有遺傳毒性。本研究設(shè)置對照組、低劑量試驗組、中劑量試驗組、高劑量試驗組，其中對照組投喂正常日糧，試驗組按劑量添加金黃疏肝應(yīng)激散，通過長達(dá)21 d的連續(xù)投喂，即使高劑量金黃疏肝應(yīng)激散也未導(dǎo)致試驗魚的肝功能異常，甚至還有降低轉(zhuǎn)氨酶活性的作用。尿素氮和肌酐水平也都沒有差異，說明即使高劑量金黃疏肝應(yīng)激散也不影響腎功能。組織學(xué)切片也沒有發(fā)現(xiàn)肝、腎和脾臟有明顯的病變發(fā)生。試驗組草魚肝臟、腎臟和脾臟與對照組相比均無顯著變化，表明金黃疏肝應(yīng)激散在組織水平上對草魚不存在明顯毒性［18］。