九阡李果實發(fā)育期主要有機酸及氨基酸含量變化

崇慧影，潘紹佐，李冰晶，劉國華，王代波

（1.貴州省生物研究所，貴陽 550009；2.三都水族自治縣九阡鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術綜合服務中心，貴州 黔南 558113）

九阡李（Prunus salicinaLindl.）為薔薇科（Rosaceae）李亞科（Pnmoideae）李屬（PrunusLinn.）李［1］，是貴州省獨有的地方早熟優(yōu)良李品種［2-4］，因產(chǎn)地九阡鎮(zhèn)而得名［5］。其因果實色澤鮮艷［6］、風味獨特［7］、早熟而聞名省內(nèi)外［8］。地方政府于2000年開始重視九阡李種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［9］，種植面積曾達933 hm2，后由于缺乏科學的育苗及栽培管理技術［10］，經(jīng)濟效益沒有達到預期，面臨低產(chǎn)低效問題，目前種植面積減至400 hm2。果實中的有機酸［11］及氨基酸是決定果實風味和品質(zhì)的重要指標，它的組成類型、比例與果實酸味、口感密切相關［12］。有學者指出李屬果實含有多種有機酸和氨基酸，多以蘋果酸［13］、奎寧酸［14］、琥珀酸［15］中的1種或2種為主要有機酸［16］，氨基酸以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸［17，18］為主，但九阡李果實中有機酸及氨基酸在發(fā)育期的變化規(guī)律鮮見相關報道。筆者以九阡李為試驗材料，研究其果實發(fā)育期有機酸及氨基酸的變化規(guī)律，旨在為今后九阡李果實品質(zhì)及其風味的形成機制研究奠定基礎，為科學栽培管理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料取自九阡李產(chǎn)地貴州省三都縣九阡鎮(zhèn)水昔村山地果園10年生九阡李樹，果園面積0.67 hm2，海拔660 m，隨機選定3株果樹，從樹冠外圍的東、南、西、北、中5個方位各選取形態(tài)和成熟度相近的果實5枚［19］，自幼果期3月10日開始采樣到果實成熟，15 d采樣1次，至果實成熟，共采樣5次。1.1.2主要試劑有機酸標準品，上海源葉生物科技有限公司；氨基酸混標標準品，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich）；色譜級乙腈，德國默克公司；醋酸鈉、三乙胺等試劑為分析純。

1.1.3 儀器與設備TG-16G型臺式高速離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；FA1204型電子天平，上海衡際科學儀器有限公司；CHA-2型氣浴恒溫搖床，蘇州威爾實驗用品公司；PS40A型超聲清洗儀，深華泰科學儀器有限公司；高效液相色譜儀：美國Waters 2695，配置Waters2998檢測器、安捷倫1260液相色譜串聯(lián)AB4000型質(zhì)譜儀、水浴氮吹儀，上海那艾儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC法檢測九阡李果實發(fā)育期有機酸的含量準確稱取樣品約1 g，加入4倍體積的0.2 mol/L偏磷酸溶液；冰水浴超聲30 min，12 000 g離心5 min，取上清液，定容至5 mL；取1 mL提取液，過0.22 μm水相濾膜，待上機檢測。

色譜條件：色譜柱為Polaris 180A C18-A（250.0mm×4.6 mm，5 μm）；流動相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；檢測波長為210 nm。

1.2.2 LC-MS法檢測九阡李果實發(fā)育期氨基酸的含量準確稱量0.5 g樣品；加入0.001 mol/L HCl的20%乙 醇 溶 液3 mL；低 溫 水 浴 超 聲30 min，4℃12 000 g離心5 min，取上清液，沉淀加入1 mL提取液重新提取2次；合并3次上清液，定容至6 mL；吸取1 mL液體，過0.22 μm水相濾膜，置于-20℃冰箱待上機檢測。

色譜條件：色譜柱為Polaris 180A C18-A（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL；檢測波長為210 nm。

2 結果與分析

2.1 發(fā)育期主要有機酸的含量變化

2.1.1 發(fā)育期有機酸的檢測分析采用HPLC法對九阡李果實樣品進行有機酸檢測，共檢測出5種有機酸，分別是琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、富馬酸、蘋果酸。在九阡李5個發(fā)育時期內(nèi)，有機酸平均含量最高為奎寧酸，達93.56 μg/g，其次為琥珀酸，平均含量為44.61 μg/g。莽草酸、蘋果酸、富馬酸平均含量較低，分別為2.03、0.64、1.40 μg/g（表1）。從有機酸平均含量來看，奎寧酸占總有機酸含量的65.78%，琥珀酸占總有機酸含量的31.36%。從有機酸積累量來看，成熟期果實5種有機酸積累量含量高低表現(xiàn)為奎寧酸＞琥珀酸＞富馬酸＞莽草酸＞蘋果酸，奎寧酸占總有機酸含量的64.35%，琥珀酸占總有機酸含量的33.16%，含量明顯高于富馬酸、莽草酸、蘋果酸，這3種有機酸僅占總有機酸含量的2.49%。

表1 有機酸含量測定

2.1.2 發(fā)育期主要有機酸的含量變化分析如圖1所示，在九阡李果實發(fā)育初期到中期奎寧酸含量逐漸減少，發(fā)育后期奎寧酸含量急劇增高達到峰值，至成熟期其含量減少至發(fā)育初期含量水平，奎寧酸含量在果實發(fā)育期有明顯變化，但成熟期奎寧酸含量與幼果期含量無明顯變化。琥珀酸在九阡李果實發(fā)育期內(nèi)含量變化整體呈先緩慢降低再緩慢升高再緩慢降低的趨勢，與奎寧酸不同，琥珀酸在整個果實發(fā)育期雖有變化，但整體波動不大，同樣在發(fā)育后期含量達到峰值（圖2）。

圖1 奎寧酸含量變化

圖2 琥珀酸含量變化

2.2 發(fā)育期氨基酸的含量變化分析

九阡李發(fā)育過程中的氨基酸含量變化如表2所示，九阡李供試樣品中共檢測出22種氨基酸，包括8種必需氨基酸。這22種氨基酸在九阡李發(fā)育過程中呈5種變化趨勢：同型半胱氨酸在九阡李果實整個發(fā)育期內(nèi)含量基本沒有變化，S-腺苷甲硫氨酸在發(fā)育期內(nèi)含量呈先升后降的趨勢，谷氨酸在發(fā)育期內(nèi)呈升-降-升-降的變化趨勢，纈氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸5種氨基酸在發(fā)育期內(nèi)呈升-降-升的變化趨勢，其余14種氨基酸呈升-降的變化趨勢。22種氨基酸在九阡李整個發(fā)育期內(nèi)，平均含量高低表現(xiàn)為天冬酰胺＞谷氨酰胺＞脯氨酸＞纈氨酸＞異亮氨酸＞絲氨酸＞γ-氨基丁酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞組氨酸＞谷氨酸＞丙氨酸＞色氨酸＞蘇氨酸＞苯丙氨酸＞酪氨酸＞精氨酸＞賴氨酸＞甘氨酸＞S-腺苷甲硫氨酸＞甲硫氨酸＞同型半胱氨酸，其中，前8種氨基酸含量＞100 μg/g，中間11種氨基酸含量處于10?100 μg/g，后3種氨基酸含量＜10 μg/g。天冬酰胺在整個發(fā)育周期內(nèi)平均含量遠高于其他21種氨基酸，平均含量達1 797.30 μg/g。九阡李成熟期氨基酸含量達100 μg/g以上的有天冬酰胺（641.62 μg/g）＞脯氨酸（396.62 μg/g）＞絲氨酸（151.86 μg/g）＞天冬氨酸（116.98 μg/g）＞纈氨酸（100.51 μg/g）。天冬酰胺、脯氨酸在總氨基酸中占比分別為33.69%、20.82%，為主要氨基酸。

表2 氨基酸含量測定 （單位：μg/g）

3 小結與討論

果實有機酸組成與含量受基因控制［20］及果實發(fā)育的調(diào)控［21］，還與其他環(huán)境因子有關。李屬果實大部分以蘋果酸為主要有機酸，而在歐洲李（Prunus domesticaL.）果實中奎寧酸含量最高，本試驗采用HPLC法在九阡李果實中檢測出5種有機酸，其中奎寧酸、琥珀酸含量遠高于其他3種有機酸，奎寧酸含量占總有機酸含量的64.35%，確定九阡李是以奎寧酸、琥珀酸為主要有機酸，這可能是導致九阡李相較于其他李品種具有獨特風味的主要原因，例如貴州省優(yōu)異李品種蜂糖李為蘋果酸型。奎寧酸和琥珀酸含量總體都呈降-升-降的變化趨勢，皆在果實發(fā)育后期達到峰值，成熟期有機酸含量降低是由于有機酸作為糖酵解、三羧酸循環(huán)（TCAC）及糖異生作用的基質(zhì)被消耗［22］，有機酸在果實發(fā)育過程中是果實品質(zhì)形成的基礎物質(zhì)和代謝能量保障［23］。通過LCMS法檢測九阡李果實在發(fā)育期內(nèi)的氨基酸含量，測出22種氨基酸，這些氨基酸在九阡李發(fā)育期內(nèi)含量變化差異明顯，共出現(xiàn)5種變化規(guī)律。其中，天冬酰胺、脯氨酸含量豐富，占總氨基酸含量的54.51%，證明九阡李區(qū)別于大多數(shù)以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸為主要氨基酸的果樹品種，天冬酰胺含量呈現(xiàn)出在果實發(fā)育前期快速增長，之后逐漸降低的變化趨勢，這可能是因為果實發(fā)育中期受有機酸快速積累的影響。而脯氨酸也在發(fā)育前期迅速積累，發(fā)育中期急劇降低后又迅速積累至果實成熟。