不同衍生劑柱前衍生-HPLC-SPD二極管陣列測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉中牛磺酸含量

王亮亮，邱宇*，陳同強(qiáng)，荊輝華，王凱，言劍

（1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410000；2.食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410000）

?；撬崾且环N含硫的β-氨基酸，是人體中重要的氨基酸之一，化學(xué)名為2-氨基乙基氨基酸[1]，分子式為C2H7NO3S，具有多種生理功能，如能促進(jìn)大腦發(fā)育及損傷修復(fù)[1-2]，促進(jìn)視覺機(jī)能[3]，提高免疫力[4]，調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)[5]，還可用于感冒，具有抗炎癥、抗氧化等功能[6-7]。

?；撬岬臋z測方法有酸堿中和滴定法[8]、分光光度計(jì)法[9]、薄層色譜法[10]、超高效液相色譜法[11]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[12]、氨基酸分析儀法[13]。近年來，從前處理方式的簡易程度、結(jié)果的正確性及樣品的穩(wěn)定性考慮，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度更高、重現(xiàn)性更好、結(jié)果更準(zhǔn)確等優(yōu)勢。但?；撬岜旧碓赟PD二極管下無光譜吸收，需進(jìn)行衍生化處理，其衍生方式可分為柱前衍生和柱后衍生兩種方式，柱前衍生的衍生劑主要有 2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）[14]、2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）[14]、丹磺酰氯（dansulfonyl chloride，Dansyl-Cl）[15]、異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）[16]、鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）[17]、熒光胺、2，3-萘基二縮醛（2，3-naphthyl dialdehyde，NDA）[14]等衍生劑；柱后衍生法主要以O(shè)PA作為衍生試劑[17]。目前國內(nèi)外還未見有關(guān)于不同衍生劑衍生測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉中牛磺酸的效果比較分析，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中牛磺酸的測定》檢測對象并不包括特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉，且因該類樣品中營養(yǎng)物質(zhì)多，產(chǎn)品基質(zhì)和結(jié)構(gòu)成分與普通食品有著較大的區(qū)別，?；撬岬臋z測易受干擾，雜峰多，甚至?xí)霈F(xiàn)假陽性結(jié)果。本文通過優(yōu)化檢測條件，建立特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉柱前衍生-高效液相色譜-SPD二極管陣列檢測法，從加標(biāo)回收、試樣檢測及操作步驟等多角度比較分析DNFB、Dansyl-Cl、OPA3種不同衍生劑對牛磺酸測定的影響，為特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：?；撬幔╰aurine，Tau）（純度≥99.9%，CAS：107-35-7，批號：CDAA-28007）：ANPEL 公司。

8種不同的特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉（濃縮乳清蛋白粉Esprion300、濃縮乳清蛋白粉TP800、特殊醫(yī)學(xué)用途蛋白質(zhì)組件配方粉、低乳糖配方粉、氨基酸代謝障礙配方粉、深度水解乳蛋白配方粉、母乳營養(yǎng)素配方粉、全營養(yǎng)配方粉）：市售。

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、碳酸鈉、乙酸鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2，4-二硝基氟苯：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；丹磺酰氯、鄰苯二甲醛：德國Merck公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀（配SPDM20A二極管陣列檢測器）：日本島津公司；DTA-27超聲波清洗器：鼎泰科技有限公司；Centrifuge 5804R離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ZWM-UT1-10實(shí)驗(yàn)室專用超純水系統(tǒng)：湖南中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

精確稱取（精確至0.000 1 g）?；撬峁腆w標(biāo)準(zhǔn)品10.06 mg，用甲醇溶解定容至10.0 mL，折算固體標(biāo)準(zhǔn)品的純度99.9%，計(jì)算得此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.005mg/mL，放于棕色玻璃瓶中-18℃冷凍保存，此為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取適量儲備液，配制中間液，濃度為100.5 μg/mL，再依次稀釋成系列濃度（2.01、5.02、10.05、20.10、40.20、60.30 μg/mL），此為標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理方法

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)表明，濃縮乳清蛋白粉Esprion300中未檢測到牛磺酸，因此采用濃縮乳清蛋白粉Esprion300作為陰性試驗(yàn)樣品。

1.3.2.1 提取

準(zhǔn)確稱取樣品1 g（精確至0.000 1 g）至于50 mL塑料離心管中，加入適量40℃溫水溶解，超聲10 min，加入亞鐵氰化鉀+乙酸鋅組合的沉淀劑，搖勻，轉(zhuǎn)移至100.0 mL容量瓶，用水沖洗離心管，合并洗液于容量瓶中，用水定容至刻度，取適量離心后的上清液，待衍生。

1.3.2.2 衍生

DNFB衍生處理：取樣品上清液及標(biāo)準(zhǔn)工作液各1.0 mL，于10 mL塑料管中，加入0.5 mL的1%DNFB衍生液（吸取DNFB 1.0 mL，用乙腈溶液定容至100.0 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用）及1.0 mL的5%Na2CO3溶液，蓋緊密封于60℃的水浴中衍生50 min，冷卻，離心，取上清液過濾后上機(jī)測定。

Dansyl-Cl衍生處理：取樣品上清液及標(biāo)準(zhǔn)工作液各1.0 mL，于10 mL塑料管中，加入1.0 mL的80 mmol/L碳酸鈉緩沖液（用鹽酸調(diào)節(jié)pH9.5），加入1.0 mL的1.5 mg/mL Dansyl-Cl衍生液（稱取 Dansyl-Cl 0.15 g，用乙腈溶液定容至100.0 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用），蓋緊密封，避光反應(yīng)90 min（每隔45 min搖勻一次），最后加入0.10 mL的20 g/L鹽酸甲胺水溶液以終止反應(yīng)，離心，取上清液過濾后上機(jī)測定。

OPA衍生處理：取樣品上清液及標(biāo)準(zhǔn)工作液各1.0 mL，于10 mL進(jìn)樣小瓶中，加入0.5 mL的OPA衍生液（稱取0.1 g OPA固體，用10.0 mL甲醇溶解，加入0.1 mL乙硫醇溶液，用0.4 mol/L的硼酸鈉緩沖液定容至50.0 mL），準(zhǔn)確反應(yīng)120 s，立即上機(jī)測定。該衍生方法不進(jìn)行批量處理，且所有試樣及標(biāo)準(zhǔn)工作液從衍生反應(yīng)至進(jìn)樣的時(shí)長需保持一致，并控制在5 min之內(nèi)。

試樣經(jīng)液相色譜-二極管陣列系統(tǒng)分析，根據(jù)保留時(shí)間、光譜圖及其二階導(dǎo)數(shù)光譜圖比較定性，外標(biāo)法定量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱，250 mm×4.6 mm，5.0 μm。流動相：A相為乙酸鈉溶液0.820 g/L，用乙酸調(diào) pH 4.2；B 相為乙腈；流動相體積比：A∶B=70∶30；流速 1.0 mL/min。柱溫：20℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用與SHIMADZU LC-20AT儀器配套的系統(tǒng)軟件LC Real Time Analysis進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，軟件LC Postrum Analysis-PDA進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。結(jié)果以平均值表示，采用WPS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉配方復(fù)雜，營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，在檢測分析時(shí)易對?；撬嵩斐筛蓴_，易造成色譜柱堵塞，故在衍生前必須除去其蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室一般采用沉淀法。試驗(yàn)考察對比了亞鐵氰化鉀+乙酸鋅組合鹽析沉淀、乙腈有機(jī)沉淀2種不同沉淀方式對?；撬崽崛⌒屎突厥章实挠绊?，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同沉淀方式對?；撬岷康挠绊慒ig.1 Effect of different precipitation methods on content of taurine

圖2 不同沉淀方式對?；撬峄厥章实挠绊慒ig.2 Effect of different precipitation methods on recovery of taurine

圖1和圖2結(jié)果表明，使用亞鐵氰化鉀+乙酸鋅組合沉淀劑的3種衍生方式，其?；撬岷亢突厥章示哂谝译娉恋矸?，可能是牛磺酸在乙腈中的溶解度較低，乙腈在沉淀干擾物的同時(shí)也沉淀了牛磺酸[11]，同時(shí)部分樣品的濾液出現(xiàn)輕微渾濁；亞鐵氰化鉀+乙酸鋅通過氰化亞鐵酸鋅絡(luò)合物沉淀干擾物質(zhì)，樣品濾液均澄清透明，?；撬崽崛÷矢?，故選擇亞鐵氰化鉀+乙酸鋅進(jìn)行干擾物質(zhì)的去除。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 吸收波長的選擇

用SHIMADZU SPD-M20A檢測器于190nm～800nm的波長范圍內(nèi)對3種不同的標(biāo)準(zhǔn)工作液（40 μg/mL）衍生液進(jìn)行光譜全波長掃描，結(jié)果見圖3。

圖3 3種不同衍生劑衍生的?；撬峁庾V圖Fig.3 Spectra of taurine derived with three different derivatizing agents

從圖3可以看出，DNFB、Dansyl-Cl、OPA 分別在354、249、334nm 處有較大吸收，故選擇 354、249、334nm為相應(yīng)衍生方式的最佳波長。

2.2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)選取了ZORBAX SB-C18和BEH RP 18兩種不同色譜柱，比較其對?；撬岱蛛x效果的影響，以O(shè)PA衍生方式為代表，結(jié)果見圖4。

圖4 色譜柱對牛磺酸分離效果的影響Fig.4 Effect of chromatographic column on separation of taurine

圖4結(jié)果顯示，采用ZORBAX SB-C18柱的色譜峰細(xì)且窄，無拖尾現(xiàn)象，雜質(zhì)與目標(biāo)物分離效果較好，柱效優(yōu)于BEH RP 18，故選擇ZORBAX SB-C18。

2.3 方法學(xué)考察與比較分析

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限比較分析

按照1.3.2前處理后，試樣經(jīng)HPLC-PDA系統(tǒng)分析，以目標(biāo)物的峰面積（Y軸）-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度（X軸）繪制一元線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)參數(shù)結(jié)果見表1。

表1 不同衍生方式的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 1 Linear relationship，limit of detection，and limit of quantitation of different derivatizing agents

由表1可知，3種衍生劑處理的?；撬豳|(zhì)量濃度在 2.01 μg/mL～60.30 μg/mL 的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.999以上，符合方法驗(yàn)證規(guī)范要求。根據(jù)GB/T5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則》，以3倍空白樣品噪音比（S/N）和10倍空白樣品噪音比（S/N）確定 DNFB、Dansyl-Cl、OPA 衍生的方法檢出限（limits of detection，LOD）和方法定量限（limits of quantification，LOQ），當(dāng)稱樣量為 1.0 g，定容體積為 100 mL 時(shí)，DNFB、Dansyl-Cl、OPA 3 種衍生方法的 LOD 分別為 1.5、1.5、2.0 mg/100 g，LOQ 分別為5.0、5.0、6.0 mg/100 g。

2.3.2 回收率和精密度比較分析

通過對標(biāo)識無牛磺酸的濃縮乳清蛋白粉Esprion300樣品進(jìn)行本底測試及低、中、高3水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為20、40 mg/100 g和80 mg/100 g，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），同時(shí)做空白試驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表2 不同衍生方式加標(biāo)樣品的回收率及精密度（n=6）Table 2 Recovery and precision of spiked samples with different derivatizing agents（n=6）

加標(biāo)回收結(jié)果證明了3種衍生劑衍生?；撬岱椒ǖ目煽啃裕浠厥章蕿?4.4%～103.7%，相對偏差RSD保持在3.1%～8.5%之間，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》方法驗(yàn)證規(guī)范要求（RSD≤15%），說明該3種方法能滿足特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉中?；撬岬臏y定要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3.3 穩(wěn)定性比較分析

為考察衍生液的穩(wěn)定性，將進(jìn)樣小瓶中衍生后的標(biāo)準(zhǔn)工作液（質(zhì)量濃度為20.10 μg/mL），于-4℃冰箱中避光保存，分別在 0、12、24、36、48、72 h 進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每次連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見圖5。

圖5 不同時(shí)間段不同衍生方法的穩(wěn)定性研究（n=6）Fig.5 Stability of different derivation methods in different time periods（n=6）

圖5表明DNFB在72 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，每次連續(xù)6針的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%，說明DNFB具有很好的穩(wěn)定性[18]。Dansyl-Cl的衍生物在48 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，但隨后呈下降趨勢；OPA衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，分解率高，衍生物?；撬岷拷档偷每欤@與相關(guān)研究結(jié)果保持一致[19]，且每次連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD＞10%，重復(fù)性差。

2.4 實(shí)際樣品檢測結(jié)果比較

特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉中?；撬岬暮恳姳?。3種不同衍生方式的牛磺酸樣品色譜圖見圖6。

表3 特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉中牛磺酸的含量（n=6）Table 3 Content of taurine in formula powder for special medical use（n=6） mg/100 g

圖6 3種不同衍生方式的?；撬針悠飞V圖Fig.6 Chromatograms of taurine derived with three different agents

表3結(jié)果表明，濃縮乳清蛋白粉Esprion 300未檢出?；撬?，其余均有檢出，且含量基本與標(biāo)簽標(biāo)示值保持一致，在誤差范圍內(nèi)，其中Dansyl-Cl衍生的牛磺酸含量略偏低于其他兩種，Dansyl-Cl樣品色譜圖（圖6），目標(biāo)物附近雜峰較多，目標(biāo)物積分不明確，容易干擾測定，可能是因?yàn)镈ansyl-Cl雖然適合對含有仲胺等結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)行衍生，但反應(yīng)副產(chǎn)物多，使得目標(biāo)物與其他具有相同紫外吸收性質(zhì)的物質(zhì)無法獲取良好的分離度[20]。DNFB、OPA衍生方式的含量略高，可能是衍生物附近無干擾，與其他成分分離效果比較好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高。

2.5 3種衍生方式操作過程比較

試驗(yàn)以批量處理20批次樣品為例，從檢測總時(shí)長、衍生操作步驟及結(jié)果準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等方面比較了 DNFB、Dansyl-Cl、OPA 3 種不同衍生處理方法，結(jié)果見表4。

表4 不同衍生方法整體比較Table 4 Overall comparison of different derivatizing agents

從表4檢測時(shí)間及衍生操作過程看，OPA單個(gè)衍生時(shí)間短，僅5 min，但對衍生反應(yīng)的時(shí)間要求嚴(yán)格，且不能批量衍生，檢測總時(shí)長遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種，說明OPA衍生不適合檢測樣本較多的情況，其他兩種衍生過程均為60 min，檢測總時(shí)長基本一致，衍生過程可批量處理，相對簡單。從衍生物穩(wěn)定性及結(jié)果準(zhǔn)確性看，OPA衍生過程重復(fù)性差，衍生物不穩(wěn)定，但是結(jié)果準(zhǔn)確性高，DNFB和Dansyl-Cl衍生物穩(wěn)定，可重復(fù)使用，但是Dansyl-Cl衍生反應(yīng)副產(chǎn)物多，容易形成干擾和出現(xiàn)假陽性結(jié)果。從回收率看，DNFB、Dansyl-Cl、OPA回收率基本保持一致，為94.4%～103.7%，說明該3種檢測方法均能滿足特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉中?；撬岬臏y定要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉經(jīng)溫水溶解、超聲輔助提取、以DNFB、dansyl-Cl、OPA為衍生劑的3種不同柱前衍生方法，高效液相色譜-SPD二極管陣列檢測器測定?；撬岬臋z測方法。結(jié)果顯示，3種不同的衍生方式均能滿足特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉中?；撬岬臏y定，Dansyl-Cl衍生雖相對穩(wěn)定，但是反應(yīng)活性較差，反應(yīng)速度慢，易生成多級衍生產(chǎn)物干擾測定，OPA衍生前處理復(fù)雜，對生化反應(yīng)要求嚴(yán)格，衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，分解率高。DNFB衍生更能凸顯優(yōu)勢，該方法不受樣品基質(zhì)干擾，相對快速，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確性高，衍生物穩(wěn)定性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方粉等復(fù)雜基質(zhì)中牛磺酸的檢測。