野生靈芝馴化前后子實體活性成分比較

張彬彬，王慧真，劉曉雪，郭金英，王春霞，鄭素月*

（1.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021）

靈芝是一種具有食用和藥用價值的傳統(tǒng)真菌[1]。靈芝子實體含有豐富的活性成分，如靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質(zhì)和微量元素等，多年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和深入研究[2]。已經(jīng)證實靈芝活性成分具有抗氧化[3-5]、抗腫瘤[6-7]、保肝護(hù)肝[8]、預(yù)防糖尿病[9]、改善抑郁行為[10]、提高機(jī)體免疫力[11]、抑制肥胖[12]等多種生物活性。

目前，研究表明人類的許多慢性疾病和衰老現(xiàn)象均與人體內(nèi)的自由基水平失衡有關(guān)。清除自由基等抗氧化研究越來越受到重視[13]。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基[14]，被廣泛用于評價天然化合物的抗氧化活性。

野生靈芝和栽培靈芝活性成分及藥理作用是否存在顯著差異，學(xué)術(shù)界意見不統(tǒng)一。曹恒生等[15]研究表明野生靈芝的多糖含量比栽培靈芝的高；周春紅等[16]認(rèn)為栽培靈芝和野生靈芝的活性成分差異不是很大；莫崢嶸等[17]對海南栽培靈芝與野生靈芝的5個樣本的總糖含量進(jìn)行比較分析，得出結(jié)論為栽培海南赤芝和栽培信州赤芝的總糖含量比野生海南赤芝的低，但高于野生黃邊靈芝和野生海南靈芝的總糖含量；孟國良等[18]研究表明同一菌株栽培的子實體多糖和三萜含量明顯高于相應(yīng)的野生子實體。目前大多研究都是對不同菌株的野生靈芝與栽培靈芝主要活性成分的比較研究，但對于同一菌株野生靈芝子實體及馴化后子實體進(jìn)行比較的研究較少。本研究以采自河南省南召縣的30個野生靈芝為研究對象（30個靈芝的種質(zhì)鑒定和出芝試驗已另文報道[19]），對其中能馴化出芝的25個靈芝菌株馴化前后的子實體主要活性成分差異進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開發(fā)高活性的野生靈芝資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

供試野生靈芝菌株25個（采集自河南省安陽市南召縣），由河北工程大學(xué)食用菌實驗室分離和保藏，菌株編號見表1。

表1 供試菌株Table 1 Strains for test

1.1.2 試劑

甲醇（分析純）：萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；三氯乙酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；高氯酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸（分析純）：天津歐博凱化工有限公司；鐵氰化鉀（分析純）、重蒸酚（C6H6O，分析純）、香草醛（分析純）、熊果酸（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250（生物染色劑）、DPPH：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；722S可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；凱特離心機(jī)（TG18G）：鹽城市凱特試驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

按照栽培袋培養(yǎng)基配方（棉籽殼86%、麥麩12%、石灰1%、石膏1%）準(zhǔn)確稱取配料，制作培養(yǎng)袋，接種后25℃恒溫培養(yǎng)25 d，長滿袋后生理后熟10 d進(jìn)入出菇管理。將菌袋移至出菇棚內(nèi)，棚室要求有少量散射光，空氣濕度保持在80%～90%，溫度保持在25℃～28℃，最高溫度不超過30℃。采收第一潮子實體并剪碎、80℃烘干至恒重，粉碎，過20 mm篩，保存在干燥器中備用。

1.3.2 靈芝多糖含量測定

采用傳統(tǒng)熱水回流提取法提取靈芝多糖，并參考文獻(xiàn)[20]所述用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量測定。

1.3.3 靈芝三萜含量測定

采用乙醇回流提取法提取靈芝三萜[21]，并參考文獻(xiàn)[22]所述用香草醛-高氯酸-冰乙酸顯色法測定靈芝三萜的含量。

1.3.4 靈芝粗蛋白含量測定

采用凱氏定氮法測定靈芝粗蛋白含量[23]。

1.3.5 靈芝可溶性蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定靈芝可溶性蛋白含量[24]。

1.3.6 靈芝灰分含量測定

采用馬弗爐灼燒法測定靈芝灰分含量[25]。

1.3.7 靈芝水提取液體外抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率測定參照Hu等[26]的方法；總還原力測定參照Tulsawani等[27]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株靈芝子實體營養(yǎng)成分的測定結(jié)果

2.1.1 采集野生靈芝子實體營養(yǎng)成分對比分析

不同菌株野生靈芝活性成分含量分析見表2。

表2 不同菌株野生靈芝活性成分含量分析Table 2 Analysis of active components in wild Ganoderma lucidum

由表2可知，25個野生靈芝的多糖含量為33.20%～57.30%，YL-14最高達(dá)到 57.30%，YL-31最低，為 33.20%；三萜含量為 2.65 mg/g～11.30 mg/g，YL-40最高，YL-37最低；粗蛋白含量為6.52%～15.63%，YL-68最高，YL-37最低；可溶性蛋白含量為1.78 mg/g～6.29 mg/g，YL-82最高，YL-37最低；灰分含量為1.33%～3.91%，YL-8最高，YL-51最低。不同菌株之間活性成分含量多數(shù)存在顯著性差異。

2.1.2 馴化后靈芝子實體活性成分測定結(jié)果

不同菌株馴化后靈芝活性成分含量分析見表3。

表3 不同菌株馴化后靈芝子實體活性成分含量分析Table 3 Analysis of active components in Ganoderma lucidum fruiting bodies after domestication by different strains

由表3可知，25個栽培靈芝的多糖含量為31.55%～49.40%，YL-89最高達(dá)到49.40%，YL-57最低為 31.55%；三萜含量為 5.59mg/g～9.90mg/g，YL-42最高，YL-49最低；粗蛋白含量為8.65%～15.85%，YL-83最高，YL-81最低；可溶性蛋白含量為2.48 mg/g～10.04 mg/g，YL-18最高，YL-8最低；灰分含量為0.98%～2.22%，YL-18最高，YL-31最低。不同菌株之間活性成分含量多數(shù)存在顯著性差異。

2.2 同一菌株野生靈芝菌株馴化前后子實體營養(yǎng)成分對比

2.2.1 多糖含量對比分析

同一菌株野生靈芝馴化前后子實體的多糖含量分析見圖1。

圖1 同一野生靈芝菌株馴化前后子實體多糖含量對比Fig.1 Comparison of polysaccharide content in fruiting bodies of the same wild Ganoderma lucidum strain before and after domestication

由圖1可知，同一菌株野生靈芝馴化前后子實體的多糖含量差異較大，除菌株YL-68和YL-61外，其他菌株野生靈芝多糖含量均高于其栽培靈芝的多糖含量，并且均呈現(xiàn)顯著或極顯著性差異。

2.2.2 三萜含量對比分析

同一菌株野生靈芝馴化前后子實體的三萜含量分析見圖2。

圖2 同一野生靈芝菌株馴化前后子實體三萜含量對比Fig.2 Comparison of triterpenoid contents in fruiting bodies of the same wild Ganoderma lucidum strain before and after domestication

由圖2可知，同一菌株野生靈芝馴化前后子實體的三萜含量差異較大，與多糖含量不同，YL-15、YL-8等10個菌株的野生靈芝三萜含量高于其栽培靈芝的三萜含量。

2.2.3 粗蛋白含量對比分析

同一菌株野生靈芝馴化前后子實體的粗蛋白含量分析見圖3。

圖3 同一野生靈芝菌株馴化前后子實體粗蛋白含量對比Fig.3 Comparison of crude protein content in fruiting bodies of the same wild Ganoderma lucidum strain before and after domestication

由圖3可知，野生靈芝粗蛋白含量高于其馴化后子實體的菌株只有9個，占比僅36%，馴化后靈芝菌株YL-83和YL-88子實體表現(xiàn)出較高的粗蛋白含量潛力。

2.2.4 可溶性蛋白含量對比分析

同一菌株野生靈芝馴化前后子實體的可溶性蛋白含量分析見圖4。

圖4 同一野生靈芝菌株馴化前后子實體可溶性蛋白含量對比Fig.4 Comparison of soluble protein content in fruiting bodies of the same wild Ganoderma lucidum strain before and after domestication

由圖4可知，多數(shù)野生靈芝可溶性蛋白含量低于其馴化后子實體的含量，且馴化后靈芝菌株YL-83、YL-61和YL-18表現(xiàn)出高可溶性蛋白含量潛力。

2.2.5 灰分含量對比分析

同一菌株野生靈芝馴化前后子實體的灰分含量分析見圖5。

圖5 同一野生菌株馴化前后子實體灰分含量對比Fig.5 Comparison of ash content in fruiting bodies of the same wild Ganoderma lucidum strain before and after domestication

由圖5可知，大部分野生靈芝菌株的灰分含量高于其馴化后子實體，且存在極顯著性差異，菌株YL-8的馴化前灰分含量最高，菌株YL-89和YL-76的野生靈芝灰分與馴化后子實體灰分含量接近，無顯著性差異。

2.3 體外抗氧化活性

不同菌株靈芝子實體水提取液體外抗氧化活性分析見表4。

表4 不同菌株靈芝水提取液體外抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of Ganoderma lucidum aqueous extract in vitro

由表4可知，野生靈芝馴化前后子實體的水提液都具有一定的抗氧化活性，不同菌株之間DPPH自由基清除率存在較大差異，馴化前后水提液的DPPH自由基清除率范圍分別為55.40%～88.54%和36.60%～64.90%；不同菌株靈芝水提取液對Fe2+具有一定的還原力，并且與DPPH自由基清除率的趨勢一致，馴化前子實體水提液的體外抗氧化活性均高于馴化后子實體，其中YL-8、YL-68和YL-40表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同靈芝菌株之間及同一菌株馴化前后子實體之間營養(yǎng)成分含量存在顯著性差異，大部分野生靈芝的多糖和灰分含量高于其馴化后子實體，而大部分菌株馴化后子實體的三萜、粗蛋白和可溶性蛋白含量高于野生靈芝。馴化前水提液的體外抗氧化活性均高于馴化后子實體，造成這種現(xiàn)象的原因，可能是由于靈芝多糖易溶于水，而靈芝三萜不易溶于水，所以靈芝水提液的體外抗氧化活性與靈芝多糖含量測定結(jié)果的趨勢較為接近，例如YL-8、YL-68和YL-40表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

不同種類靈芝、靈芝不同部位以及靈芝不同的生長階段所含的靈芝活性成分含量和種類會有所差異[28]，一些關(guān)于野生蘑菇的報告稱，環(huán)境因素和自然生境可能是影響活性成分含量及構(gòu)成的重要因素，如Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)熱脅迫可促進(jìn)靈芝三萜的生物合成，Stojkovi等[30]證明靈芝的化學(xué)和生物活性特性高度依賴于樣品的來源。因此簡單地說野生靈芝價值高于栽培靈芝較片面。本研究對野生靈芝和栽培靈芝提出更客觀的認(rèn)識，為理性消費(fèi)市場上靈芝產(chǎn)品提供參考依據(jù)，同時充分挖掘利用南召縣豐富野生靈芝資源的潛在價值，為野生靈芝馴化必要性提供理論依據(jù)。