香蕉皮總黃酮的提取及其抗氧化和抑制酪氨酸酶的活性

彭思琪，王娟*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.廣東省香蕉精深加工與綜合利用工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510641）

香蕉廣泛種植于熱帶地區(qū)[1]，是世界上廣泛食用的第二大重要水果作物[2-3]。我國為香蕉生產(chǎn)大國，2019年香蕉產(chǎn)量達1 165.6萬噸[4]。香蕉皮作為香蕉食用和加工過程中的主要副產(chǎn)物，占香蕉果實總質(zhì)量的30%～40%[5]。香蕉皮含有豐富的果膠、酚類化合物、纖維、礦物質(zhì)、糖類[6-8]及黃酮類化合物[9]等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的利用價值，其中，香蕉皮中總黃酮含量隨香蕉品種、成熟度等條件的變化而發(fā)生變化。但目前，香蕉皮被作為廢棄物[10]，未得到充分利用。

目前，對于香蕉皮總黃酮的提取工藝優(yōu)化、抗氧化性及抗菌活性等方面已有較多研究。Ishak等[11]、Hernández-Carranza等[12]分別采用超聲輔助提取和攪拌提取方法提取香蕉皮總黃酮，并證明了香蕉皮總黃酮具有DPPH、ABTS+自由基清除能力及Fe3+還原能力，但對于香蕉皮總黃酮抑制酪氨酸酶活性的研究較少。

細胞中的酪氨酸經(jīng)催化氧化形成黑色素，酪氨酸酶在該過程中起到至關(guān)重要的作用，因此可通過抑制酪氨酸酶的活性抑制黑色素的形成[13]。目前，具有抑制酪氨酸酶活性的化學(xué)物質(zhì)（如對苯二酚、曲酸等）可能會對皮膚產(chǎn)生刺激、引發(fā)接觸性皮炎等，使用過程中可能存在副作用[14]。因此，植物天然成分對酪氨酸酶的抑制作用逐漸受到研究者們的關(guān)注。黃酮類化合物主要通過氫鍵作用和酪氨酸酶結(jié)合，改變酶構(gòu)象結(jié)構(gòu)，從而達到抑制酶催化活性的作用[15]。朱丹等[16]、吳穎等[17]分別發(fā)現(xiàn)橘黃酮粗提物、蒲公英黃酮具有抑制酪氨酸酶的活性，具有潛在抑制黑色素生成的功效。

基于此，本文在優(yōu)化香蕉皮總黃酮提取工藝的基礎(chǔ)上，探究香蕉皮總黃酮的抗氧化和抑制酪氨酸酶的活性，為綜合利用香蕉皮提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉：市售；九水合硝酸鋁（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，≥98%）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、L-多巴（均為分析純）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、30%過氧化氫（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；硫酸亞鐵（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；醋酸鉀、水楊酸、三氯化鐵（均為分析純）：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸（均為分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；L-酪氨酸（分析純）：上海伯奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見光分光光度計（UV-1800）：日本島津公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）：上海亞榮生化儀器廠；超聲清洗機（KQ-300DE）：昆山市超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機（JW-3021HR）：安徽嘉文儀器裝備有限公司；恒溫振蕩器（SHA-B）：常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理及香蕉皮顆粒的制備

香蕉成熟度評價參照參考文獻[18]中的方法，本試驗中香蕉的2種成熟度分別為成熟度1級（香蕉皮全綠）和成熟度6級（香蕉皮全黃，無明顯黑斑）。將香蕉皮清洗干凈，切去兩端，并將其切成大小均勻的1 cm2的塊狀，液氮速凍后使用破壁機進行粉碎，得到香蕉皮顆粒，樣品置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 香蕉皮總黃酮提取工藝

參照王亞君[19]的方法，稍作改動。取香蕉皮顆粒3 g，以一定的料液比、乙醇濃度、溫度和超聲時間進行超聲輔助提取，將提取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在4 500 r/min下離心10 min，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮，使用無水乙醇將濃縮后的溶液補足至30 mL，得到香蕉皮總黃酮樣品溶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 料液比對香蕉皮總黃酮得率的影響

固定乙醇濃度60%、溫度60℃、超聲時間60 min、超聲功率為 300 W，分別在料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的條件下進行提取，考察料液比對香蕉皮總黃酮得率的影響。

1.3.3.2 乙醇濃度對香蕉皮總黃酮得率的影響

固定料液比 1∶25（g/mL）、溫度 60 ℃、超聲時間60 min、超聲功率為300 W，分別在乙醇濃度為60%、70%、80%、90%、95%、100%的條件下進行提取，考察乙醇濃度對香蕉皮總黃酮得率的影響。

1.3.3.3 溫度對香蕉皮總黃酮得率的影響

固定料液比 1∶25（g/mL）、乙醇濃度 95%、超聲時間60 min、超聲功率為300 W，分別在溫度為30、40、50、60、70℃的條件下進行提取，考察溫度對香蕉皮總黃酮得率的影響。

1.3.3.4 超聲時間對香蕉皮總黃酮得率的影響

固定料液比 1∶25（g/mL）、乙醇濃度 95%、溫度60℃、超聲功率為300 W，分別在超聲時間為20、30、40、50、60、70 min的條件下進行提取，考察超聲時間對香蕉皮總黃酮得率的影響。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以香蕉皮總黃酮得率為指標(biāo)進行正交試驗，正交試驗的因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 香蕉皮總黃酮得率的計算

香蕉皮總黃酮含量的測定方法參照SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測定》[20]。在波長420 nm處測定吸光值，用30%乙醇溶液作為空白對照，以吸光值（Y）對質(zhì)量濃度（X，mg/mL）作圖，得到蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取待測樣品溶液5 mL，置于50 mL容量瓶中，香蕉皮總黃酮得率計算公式如下。

式中：W為香蕉皮總黃酮得率，%；c為根據(jù)吸光值計算出的溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；D為溶液稀釋倍數(shù)；V為供試品溶液體積，mL；m為香蕉皮質(zhì)量，g。

1.3.6 香蕉皮總黃酮的抗氧化活性測定

1.3.6.1 羥自由基清除能力測定

參照Hou等[21]的方法，稍作改動。樣液于37℃水浴1 h，在510 nm波長處測定吸光值，羥自由基清除率計算公式如下。

式中：A0為H2O2溶液+95%乙醇的吸光值；A1為香蕉皮總黃酮溶液+H2O2的吸光值；A2為香蕉皮總黃酮溶液+蒸餾水的吸光值。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力測定

參照Floegel等[22]的方法，稍作改動。樣液振搖均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光值，DPPH自由基清除率計算公式如下。

式中：A0為DPPH溶液+95%乙醇的吸光值；A1為香蕉皮總黃酮溶液+DPPH溶液的吸光值；A2為香蕉皮總黃酮溶液+無水乙醇的吸光值。

1.3.6.3 Fe3+還原能力測定

參考王梅霖等[23]的方法，稍作改動。取2 mL香蕉皮總黃酮溶液于試管中，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL pH7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebuffersaline，PBS），混勻后 40 ℃水浴 20 min，取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，于6 000 r/min離心10min，取1 mL上清液與6 mL蒸餾水混勻，加入0.2 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，于波長700 nm處測定吸光值。

1.3.6.4 ABTS+自由基清除能力測定

參照Re等[24]的方法，稍作改動。樣液在室溫下避光反應(yīng)4min，于734nm處測定吸光值，ABTS+自由基清除率計算公式如下。

式中：A0為ABTS溶液+95%乙醇的吸光值；A1為香蕉皮總黃酮溶液+ABTS溶液的吸光值；A2為香蕉皮總黃酮溶液+無水乙醇的吸光值。

所有抗氧化試驗中，均以VC為陽性對照進行試驗。

1.3.7 抑制酪氨酸酶活性測定

香蕉皮總黃酮和曲酸抑制酪氨酸酶活性試驗各反應(yīng)體系試劑加入量見表2。

表2 抑制酪氨酸酶活性試驗試劑加入量Table 2 Addition amounts of reagents in tyrosinase inhibition test

參照范敬宜[25]的方法，稍作改動。根據(jù)表2中C1、C2、C3、C4反應(yīng)體系準(zhǔn)確吸取相應(yīng)溶液并進行加樣，先向試管中加入香蕉皮總黃酮或者曲酸溶液、L-酪氨酸溶液（酪氨酸酶起到單酚酶作用）或者L-多巴溶液（酪氨酸酶起到二酚酶作用）和PBS（pH6.8），置于37℃中水浴10 min，向混合溶液中加入酪氨酸酶溶液，置于37℃下水浴14 min，迅速移入比色皿中，于475 nm處分別測定反應(yīng)體系C1、C2、C3、C4的吸光值A(chǔ)C1、AC2、AC3和 AC4，以曲酸為陽性對照，酪氨酸酶抑制

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)測定3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用Origin 9.1作圖，采用SPSS Statistics 22進行顯著性分析和方差分析，P＜0.05表示差異顯著。率的計算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對香蕉皮總黃酮得率的影響

料液比對香蕉皮總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 料液比對香蕉皮總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavonoids from banana peels

由圖1可知，香蕉皮總黃酮得率隨溶劑體積的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，料液比為1∶25（g/mL）時總黃酮得率最高（P<0.05），這可能是由于溶劑體積增加使黃酮類物質(zhì)溶出更加充分[26]，總黃酮得率增加。溶劑過多時，大量的乙醇溶劑會吸收一部分超聲能量，從而減少超聲能量對原料的作用，妨礙總黃酮的溶出，同時，雜質(zhì)的溶出也會使總黃酮溶解度降低[26]，導(dǎo)致香蕉皮總黃酮得率下降。故選用料液比1∶25（g/mL）為中心水平進行后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.1.2 乙醇濃度對香蕉皮總黃酮得率的影響

乙醇濃度對香蕉皮總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對香蕉皮總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from banana peels

由圖2可知，香蕉皮總黃酮得率隨乙醇濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為95%時總黃酮得率最高（P<0.05），這可能是由于黃酮類化合物的極性與95%乙醇接近[27]，利于香蕉皮總黃酮的溶出，但乙醇濃度過高可能會產(chǎn)生較大的滲透壓[28]，從而降低香蕉皮總黃酮得率。故選用乙醇濃度95%為中心水平進行后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.1.3 溫度對香蕉皮總黃酮得率的影響

溫度對香蕉皮總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 溫度對香蕉皮總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of total flavonoids from banana peels

由圖3可知，香蕉皮總黃酮得率隨溫度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，溫度為60℃時總黃酮得率最高（P<0.05），這可能是因為溫度升高，乙醇黏度減小[29]，利于香蕉皮總黃酮的溶出，但過高的溫度會導(dǎo)致乙醇溶液揮發(fā)，料液比增大，雜質(zhì)溶出量增加[29]，同時，高溫可能會導(dǎo)致黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)遭到破壞[28]，使香蕉皮總黃酮得率減小。故選用溫度60℃為中心水平進行后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.1.4 超聲時間對香蕉皮總黃酮得率的影響

超聲時間對香蕉皮總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對香蕉皮總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids from banana peels

由圖4可知，香蕉皮總黃酮得率隨超聲時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，超聲時間為50min時總黃酮得率最高（P<0.05），這可能是由于大多黃酮類化合物存在于細胞中，超聲波破壞細胞結(jié)構(gòu)[30]，使香蕉皮總黃酮不斷溶出，但超聲時間過長可能會破壞黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)[30]，導(dǎo)致香蕉皮總黃酮得率下降。故選用超聲時間50 min為中心水平進行后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.2 正交試驗結(jié)果

以香蕉皮總黃酮提取得率為評價指標(biāo)，選取料液比、乙醇濃度、溫度、超聲時間進行四因素三水平正交試驗設(shè)計，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of analysis of variance

根據(jù)表3可知，影響香蕉皮總黃酮得率的因素主次順序為 B（乙醇濃度）＞D（超聲時間）＞A（料液比）＞C（溫度），香蕉皮總黃酮的最佳提取條件組合為A1B2C2D2，即料液比為 1∶20（g/mL），乙醇濃度為 95%，溫度為60℃，超聲時間為50 min，與正交試驗中2號組合的總黃酮得率最高是一致的。根據(jù)表4可知，料液比、乙醇濃度、溫度和超聲時間對香蕉皮總黃酮提取得率都有極顯著影響。

2.3 驗證試驗

根據(jù)2.2中優(yōu)化的提取條件進行驗證性試驗，重復(fù)3次，得到香蕉皮總黃酮平均得率為1.82%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%，表明該提取工藝重復(fù)性良好，適合于香蕉皮總黃酮的提取。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 羥自由基清除率

香蕉皮總黃酮和VC對羥自由基的清除作用見圖5。

圖5 香蕉皮總黃酮和VC對羥自由基的清除作用Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activities of total flavonoids from banana peels and VC

由圖5可知，試驗考察濃度范圍內(nèi)，香蕉皮總黃酮和VC對羥自由基的清除率隨其濃度的增大而逐漸提高，其對羥自由基的清除能力大小順序為成熟度6級香蕉皮總黃酮＞成熟度1級香蕉皮總黃酮＞VC，且具有顯著性差異（P＜0.05），成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮、VC清除羥自由基的IC50值分別為0.12、0.09、15.06 mg/mL，表明香蕉皮總黃酮具有較強的羥自由基清除能力，與張兆英等[31]的研究一致。

2.4.2 DPPH自由基清除率

香蕉皮總黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用見圖6。

圖6 香蕉皮總黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activities of total flavonoids from banana peels and VC

由圖6可知，試驗考察濃度范圍內(nèi)，香蕉皮總黃酮和VC對DPPH自由基的清除率隨其濃度的增大而提高，在較低濃度（0.15 mg/mL）下，香蕉皮總黃酮和VC對DPPH自由基清除率差異顯著（P＜0.05），其大小順序為成熟度6級香蕉皮總黃酮＞成熟度1級香蕉皮總黃酮＞VC，而在較高濃度（0.35 mg/mL）下，其 DPPH 自由基清除率沒有顯著差異，成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮、VC清除DPPH自由基的IC50值分別為0.09、0.04、0.14 mg/mL，表明香蕉皮總黃酮具有較強的DPPH自由基清除能力。Hernández-Carranza等[12]以水溶性維生素E為陽性對照，研究得到香蕉皮總黃酮具有較強的清除DPPH自由基的能力，與本試驗結(jié)果一致。

2.4.3 Fe3+還原能力測定

香蕉皮總黃酮和VC對Fe3+的還原能力見圖7。

圖7 香蕉皮總黃酮和VC對Fe3+的還原能力Fig.7 Fe3+reduction abilities of total flavonoids from banana peels and VC

抗氧化劑的還原性越強，抗氧化能力越強，利用抗氧化劑可將Fe3+還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與FeCl3反應(yīng)，生成普魯士藍，普魯士藍在700 nm波長處具有最大吸光值的原理，對抗氧化劑的Fe3+還原能力進行測定，吸光值越大，說明抗氧化劑的抗氧化性越強[23]。由圖7可知，試驗濃度范圍內(nèi)，香蕉皮總黃酮和VC對Fe3+的還原能力隨其濃度的增大而提高，在每個試驗濃度下，其對Fe3+還原能力的大小為成熟度1級香蕉皮總黃酮＞成熟度6級香蕉皮總黃酮＞VC，且均具有顯著性差異（P＜0.05），表明香蕉皮總黃酮具有較強的Fe3+還原能力，與顧采琴等[32]的研究結(jié)果一致。

2.4.4 ABTS+自由基清除率

香蕉皮總黃酮和VC對ABTS+自由基的清除作用見圖8。

圖8 香蕉皮總黃酮和VC對ABTS+自由基的清除作用Fig.8 ABTS+radical scavenging activities of total flavonoids from banana peels and VC

由圖8可知，試驗濃度范圍內(nèi)，香蕉皮總黃酮和VC對ABTS+自由基的清除率隨其濃度的增大而提高，在每個試驗濃度下，香蕉皮總黃酮的ABTS+自由基清除能力均顯著高于 VC（P＜0.05）；樣品濃度為 0.055 mg/mL～0.115 mg/mL時，2種成熟度香蕉皮總黃酮的ABTS+自由基清除能力沒有顯著差異，樣品濃度上升至0.135 mg/mL時，成熟度1級香蕉皮總黃酮的ABTS+自由基清除能力顯著高于成熟度6級香蕉皮總黃酮（P＜0.05），成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮、VC清除ABTS+自由基的 IC50值分別為 0.14、0.14、0.29 mg/mL，表明香蕉皮總黃酮具有較強的ABTS+自由基清除能力。Ishak等[11]研究表明，香蕉皮總黃酮的ABTS+自由基清除率可達84.7%，表明其具有較強的清除ABTS+自由基的能力，與本試驗結(jié)果一致。

2.5 抑制酪氨酸酶活性試驗

2.5.1 抑制酪氨酸酶單酚酶活性

香蕉皮總黃酮和曲酸抑制酪氨酸酶單酚酶活性試驗結(jié)果如圖9和圖10所示。

圖9 香蕉皮總黃酮和曲酸對酪氨酸酶單酚酶的抑制作用Fig.9 Inhibitory effects of total flavonoids from banana peels and kojic acid on monophenolase activity of tyrosinase

圖10 香蕉皮總黃酮對酪氨酸酶單酚酶的抑制作用Fig.10 Inhibitory effect of total flavonoids from banana peels on monophenolase activity of tyrosinase

由圖9可知，香蕉皮總黃酮和曲酸對酪氨酸酶單酚酶的抑制率隨其濃度的增加而提高。成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮、曲酸抑制單酚酶活性的IC50值分別為0.10、0.03、0.01 mg/mL，曲酸抑制酪氨酸酶單酚酶的活性顯著高于香蕉皮總黃酮（P<0.05），而由圖10可知，當(dāng)香蕉皮總黃酮濃度增大至0.175 mg/mL時，成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮對單酚酶的抑制率可分別達到69.10%、75.35%。綜上，香蕉皮總黃酮對單酚酶的抑制作用雖然顯著低于曲酸，但在較高濃度下對單酚酶仍具有一定的抑制作用。

2.5.2 抑制酪氨酸酶二酚酶活性

香蕉皮總黃酮和曲酸抑制酪氨酸酶二酚酶活性試驗結(jié)果如圖11所示。

圖11 香蕉皮總黃酮和曲酸對酪氨酸酶二酚酶的抑制作用Fig.11 Inhibitory effects of total flavonoids from banana peels and kojic acid on diphenolase activity of tyrosinase

由圖11可知，香蕉皮總黃酮和曲酸對酪氨酸酶二酚酶的抑制率隨其濃度的增加而提高，成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮、曲酸抑制二酚酶的IC50值分別為0.15、0.14、0.11 mg/mL，成熟度1級香蕉皮總黃酮對二酚酶的抑制作用顯著低于曲酸（P<0.05），但成熟度6級香蕉皮總黃酮對二酚酶的抑制作用與曲酸基本沒有顯著性差異，在濃度為0.175 mg/mL時，成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮對二酚酶的抑制率分別為曲酸的87.91%、91.87%。結(jié)果表明，香蕉皮總黃酮對二酚酶的抑制作用雖然不及曲酸，但仍表現(xiàn)出較強的抑制二酚酶的活性。

3 結(jié)論

單因素試驗和正交試驗結(jié)果表明，香蕉皮總黃酮提取的最佳條件為料液比1∶20（g/mL）、乙醇濃度95%、溫度60℃、超聲時間50min，此時，總黃酮得率為1.82%?？寡趸囼灲Y(jié)果表明，同濃度下，香蕉皮總黃酮的羥自由基、ABTS+自由基清除能力及Fe3+還原能力均顯著強于VC；成熟度6級香蕉皮總黃酮對羥自由基的清除能力均顯著高于成熟度1級香蕉皮總黃酮，而成熟度1級香蕉皮總黃酮的Fe3+還原能力均顯著高于成熟度6級香蕉皮總黃酮。抑制酶活試驗結(jié)果表明，香蕉皮總黃酮對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶均具有一定的抑制作用，其中，濃度為0.175 mg/mL時，成熟度1級、成熟度6級香蕉皮總黃酮對二酚酶的抑制率分別相當(dāng)于同濃度下曲酸抑制率的87.91%、91.87%。因此，香蕉皮總黃酮具有較強的抗氧化活性和一定的抑制酪氨酸酶的活性，在食品等領(lǐng)域具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值。