纖細(xì)裸藻多糖提取工藝優(yōu)化及其吸濕性、保濕性

高麗偉，趙新杰，趙祥忠

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）是一類介于動(dòng)物和植物之間的單細(xì)胞真核生物，屬裸藻門裸藻屬，無(wú)細(xì)胞壁[1]，廣泛存在于自然界中。纖細(xì)裸藻中富含蛋白質(zhì)、多種不飽和脂肪酸以及生育酚等59種人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是良好的天然膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[2-4]。纖細(xì)裸藻多糖（Euglena gracilis polysaccharide，EGP）又稱副淀粉，是纖細(xì)裸藻中特有的非淀粉黏性多糖，其含量可達(dá)50%～70%。纖細(xì)裸藻多糖在天然狀態(tài)下呈現(xiàn)高度結(jié)晶，表面構(gòu)造類似海綿，有無(wú)數(shù)細(xì)小的孔，且具有不消化性，可吸附體內(nèi)有害物質(zhì)并將其排出體外，因而具有清除重金屬[5]、平衡腸道微環(huán)境[6]、調(diào)節(jié)血脂[7]、護(hù)肝[8]和抗氧化[9]等生理活性功能，另外還具有抗炎[10]、抗病毒[11]的功效。對(duì)于纖細(xì)裸藻多糖的研究，無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外都主要集中在對(duì)其活性功能及其機(jī)理的探究上，特別是關(guān)于提高免疫力、抗氧化、抗病毒等方面，但是對(duì)于纖細(xì)裸藻多糖的吸濕性、保濕性等理化性質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。

目前，多糖的提取方法主要有熱水提取法[12]、酸堿提取法[13]、酶催化法[14]以及超聲波輔助提取法[15]等，每種提取方法都有其自身的優(yōu)越性和局限性，且不同的提取方式會(huì)在一定程度上改變多糖的分子結(jié)構(gòu)和理化特性。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）不但能夠使纖細(xì)裸藻中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，而且可以加速纖細(xì)裸藻多糖從細(xì)胞膜內(nèi)釋放。本試驗(yàn)以SDS為提取劑，利用超聲波輔助法對(duì)纖細(xì)裸藻多糖進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)分析和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定纖細(xì)裸藻多糖的最佳提取工藝條件，并對(duì)纖細(xì)裸藻多糖進(jìn)行了吸濕性、保濕性分析，以期為纖細(xì)裸藻多糖在食品等相關(guān)行業(yè)中的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

纖細(xì)裸藻粉：上海光語(yǔ)生物科技有限公司；石油醚（分析純）：天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；濃硫酸（優(yōu)級(jí)純）：煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；苯酚、氫氧化鈉、葡萄糖、十二烷基硫酸鈉（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；丙三醇（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5100紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；KQ-100DE數(shù)控超聲波儀：昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Rapid N型快速定氮儀：艾力蒙塔貿(mào)易（上海）有限公司；LG-0.2真空冷凍干燥機(jī)：沈陽(yáng)航天新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 纖細(xì)裸藻多糖的提取

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法對(duì)纖細(xì)裸藻多糖進(jìn)行提取，并作如下修改：利用索氏提取法對(duì)纖細(xì)裸藻粉進(jìn)行脫脂預(yù)處理。稱取一定質(zhì)量的脫脂纖細(xì)裸藻粉，將之懸浮在一定濃度和適當(dāng)料液比的SDS溶液中，混合均勻，然后在一定的超聲功率下處理一段時(shí)間，于6 000 r/min下離心10 min，去除上清液，再加入1.5 g/L的SDS溶液，在相同的轉(zhuǎn)速下離心10 min，倒掉上清液，重復(fù)該操作2次，最后用蒸餾水反復(fù)洗滌，冷凍干燥得到纖細(xì)裸藻多糖。

1.3.2 纖細(xì)裸藻多糖含量測(cè)定

1.3.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

移取100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL離心管中，以1 mL蒸餾水作空白，室溫下加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，迅速搖勻后，置于60℃水浴反應(yīng)8 min。用紫外分光光度計(jì)在400 nm～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以確定最大波長(zhǎng)。通過掃描結(jié)果可知其最大吸收峰值在490 nm處。

1.3.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以1 mL蒸餾水為空白，分別移取濃度為0、20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液各 1 mL 加入10 mL離心管中，在每支離心管中依次加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL后，迅速搖勻，置于60℃恒溫水浴8 min，以冷水浴5 min終止反應(yīng)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定490 nm處的吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A490）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.3 纖細(xì)裸藻多糖得率的計(jì)算

參照1.3.2.2的步驟，利用苯酚-硫酸法[17]進(jìn)行纖細(xì)裸藻多糖含量的測(cè)定。按以下公式計(jì)算纖細(xì)裸藻多糖得率。

式中：C為濃度，μg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液總體積，mL；M為原料質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）SDS濃度：在超聲功率100 W、超聲時(shí)間20 min、料液比 1∶20（g/mL）的條件下，考察 SDS 濃度（5、10、15、20、25、30 g/L）對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響。

2）料液比：在超聲功率100 W、超聲時(shí)間20 min、SDS 濃度為 10 g/L 的條件下，考察料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響。

3）超聲時(shí)間：在超聲功率100W、SDS濃度為10g/L、料液比 1∶20（g/mL）的條件下，考察超聲時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min）對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響。

4）超聲功率：在超聲時(shí)間20 min、SDS濃度10 g/L、料液比 1∶20（g/mL）的條件下，考察超聲功率（60、80、100、120、140、160 W）對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取SDS濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、料液比（C）為自變量，以纖細(xì)裸藻多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.3.5 纖細(xì)裸藻多糖吸濕性及保濕性測(cè)定

1.3.5.1 吸濕性的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法修改如下：將超聲波輔助提取法得到的纖細(xì)裸藻多糖粉碎分散，干燥至質(zhì)量恒定，以甘油為對(duì)照。分別稱取上述多糖樣品和甘油各0.300 0 g于培養(yǎng)皿中（敞口），（25±2）℃條件下，放置于裝有硫酸銨飽和溶液（相對(duì)濕度81%）的干燥器中。分別在 4、8、12、16、24、32、36 h 時(shí)，稱量樣品質(zhì)量，并根據(jù)下列公式計(jì)算吸濕性。

式中：Mn為不同時(shí)間段樣品的質(zhì)量，g；M0為樣品的初始質(zhì)量，g。

1.3.5.2 保濕性的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法修改如下：準(zhǔn)確稱取0.300 0 g的多糖樣品和甘油，分別加入0.2 g去離子水，混合均勻后置于2個(gè)潔凈干燥的培養(yǎng)皿中，（25±2）℃條件下，放入裝有微粉硅膠的干燥器，在放置時(shí)間為4、8、12、16、24、32、36 h 時(shí)，分別稱量樣品質(zhì)量，并根據(jù)以下公式計(jì)算保濕性。

式中：Mx為不同時(shí)間段樣品的質(zhì)量，g；M1為含水樣品的初始質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)做3個(gè)平行，利用Origin 2017、IBM SPSS以及Design-Expert 11進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Fig.1 Standard curve and regression equation of glucose

由圖1可知，得到的線性回歸方程為y=0.010 1x+0.0096，R2=0.9978，表明在質(zhì)量濃度為0～100μg/mL時(shí)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 SDS濃度對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響

SDS濃度對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響見圖2。

圖2 SDS濃度對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響Fig.2 The effect of SDS concentration on the yield of Euglena gracilis polysaccharide

由圖2可知，SDS濃度在5 g/L～15 g/L時(shí)，SDS濃度的增加會(huì)顯著影響多糖得率，當(dāng)SDS濃度大于15 g/L時(shí)，多糖得率趨于平穩(wěn)。SDS濃度為15 g/L時(shí)，多糖得率最大，為32.56%。因此，選擇SDS濃度為10、15、20 g/L進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 料液比對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響

料液比對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the yield of Euglena gracilis polysaccharide

由圖3可知，隨著溶劑體積的不斷增大，纖細(xì)裸藻多糖得率逐漸上升，并在1∶25（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，為34.63%，當(dāng)溶劑體積繼續(xù)增大時(shí)多糖得率略有下降。因此，選擇料液比為 1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic time on the yield of Euglena gracilis polysaccharide

由圖4可知，在5 min～20 min內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)多糖得率逐漸提高，超聲時(shí)間為20 min時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，為29.39%，當(dāng)超聲時(shí)間大于20 min時(shí)，纖細(xì)裸藻多糖的得率逐漸下降。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)體系的溫度升高，溫度過高會(huì)引起多糖分解。因此，選擇超聲時(shí)間為15、20、25 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.4 超聲功率對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響

超聲功率對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the yield of Euglena gracilis polysaccharide

由圖5可知，當(dāng)超聲功率為60 W～100 W時(shí)，纖細(xì)裸藻多糖得率隨超聲功率的增大逐漸升高，在超聲功率為100 W時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，為31.21%。但是當(dāng)超聲功率大于100 W時(shí)，得率整體開始下降并趨于平穩(wěn)，這可能是超聲功率達(dá)到一定程度后會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，從而引起多糖得率下降。因此，超聲功率選擇100 W為佳。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

利用Design-Expert 11軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=34.06+1.3A-0.2612B-0.5125C-0.7550AB-0.16AC+0.1025BC-1.19A2-1.52B2-0.993 5C2。

2.3.2 回歸方程方差分析

回歸方程方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

由表3可知，模型P＜0.01，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.906 9，不顯著，說明模型擬合程度好[20]；相關(guān)系數(shù)R2=0.987 9，校正決定系數(shù)R2=0.972 2，說明模型可靠，可以用此模型對(duì)超聲波輔助提取纖細(xì)裸藻多糖得率的工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)B影響顯著，交互項(xiàng)BC影響不顯著，其他項(xiàng)均存在極顯著性差異。各試驗(yàn)因素對(duì)指標(biāo)的影響程度可由F值的大小體現(xiàn)，F(xiàn)值越大表明對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響越大[21]，因此各因素的影響大小順序?yàn)锳＞C＞B，即SDS濃度＞料液比＞超聲時(shí)間。

通過回歸模型分析可知，纖細(xì)裸藻多糖的最優(yōu)提取條件為 SDS 濃度 19.71 g/L，料液比 1∶20.11（g/mL），超聲時(shí)間17.07 min；在此工藝下纖細(xì)裸藻多糖的得率為35.45%。結(jié)合實(shí)際的試驗(yàn)操作條件，將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為 SDS 濃度 20 g/L，料液比 1∶20（g/mL），超聲時(shí)間17 min，進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，所得多糖的得率為35.28%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.17%，說明通過響應(yīng)面法可以對(duì)纖細(xì)裸藻多糖的提取工藝進(jìn)行回歸分析和優(yōu)化，具有一定的參考價(jià)值。

2.3.3 各因素之間交互作用

SDS濃度、超聲時(shí)間、料液比的兩兩交互作用對(duì)多糖得率的影響見圖6～圖8。

圖6 SDS濃度和超聲時(shí)間交互作用對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響Fig.6 Effect of the interaction of SDS concentration and ultrasound time on the yield of Euglena gracilis polysaccharides

圖7 SDS濃度和料液比交互作用對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響Fig.7 Effect of the interaction of SDS concentration and solidliquid ratio on the yield of Euglena gracilis polysaccharides

圖8 超聲時(shí)間和料液比交互作用對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響Fig.8 Effect of the interaction of ultrasound time and solidliquid ratio on the yield of Euglena gracilis polysaccharides

由圖6～圖7可知，SDS濃度（A）和超聲時(shí)間（B）兩個(gè)因素交互作用的等高線接近橢圓，響應(yīng)面坡度較陡峭，因此對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率影響顯著；SDS濃度（A）和料液比（C）交互作用的響應(yīng)面坡度較陡峭，等高線呈橢圓形，表明這兩種因素的交互作用影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.4 吸濕性及保濕性分析

2.4.1 吸濕性

纖細(xì)裸藻多糖樣品和甘油的吸濕性結(jié)果見圖9。

圖9 纖細(xì)裸藻多糖樣品和甘油的吸濕性Fig.9 Moisture absorption capacities of Euglena gracilis polysaccharide samples and glycerine

由圖9可知，纖細(xì)裸藻多糖樣品的吸濕性在0～12h隨時(shí)間延長(zhǎng)迅速上升，之后逐漸趨于平穩(wěn)，并在24 h時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)。EGP在飽和狀態(tài)下的吸濕性為19.07%，可達(dá)到甘油飽和狀態(tài)下吸濕性的70.32%。

2.4.2 保濕性

纖細(xì)裸藻多糖樣品和甘油的保濕性結(jié)果見圖10。

圖10 纖細(xì)裸藻多糖樣品和甘油的保濕性Fig.10 Moisture retention capacities of Euglena gracilis polysaccharide samples and glycerine

由圖10可知，在微粉硅膠環(huán)境中，纖細(xì)裸藻多糖樣品和甘油在0～24 h的保濕性均持續(xù)下降，之后下降的趨勢(shì)逐漸趨于平穩(wěn)。在32 h達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)纖細(xì)裸藻多糖的保濕性為46.16%，甘油的保濕性為68.45%，說明纖細(xì)裸藻多糖具有良好的保濕性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法對(duì)纖細(xì)裸藻中的多糖進(jìn)行提取，首先通過單因素試驗(yàn)確定關(guān)鍵的影響因素，再進(jìn)一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化纖細(xì)裸藻多糖的提取工藝條件。結(jié)果表明，各因素對(duì)纖細(xì)裸藻多糖得率的影響大小為SDS濃度＞料液比＞超聲時(shí)間。纖細(xì)裸藻多糖的最佳提取工藝條件為SDS濃度20 g/L，料液比1∶20（g/mL），超聲時(shí)間 17 min，在此條件下多糖得率為35.28%。另外，通過該方法提取得到的纖細(xì)裸藻多糖具有良好的吸濕性、保濕性，本試驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究提取纖細(xì)裸藻多糖提供了依據(jù)。