蜂王漿及其提取物對失眠小鼠的睡眠改善作用

蘭天，汪玲，余賢嫻，余春濤，姚虹，徐和迪，譚惠子*，聶少平

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國-加拿大食品學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西省生物活性多糖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西汪氏蜜蜂園有限公司，江西 南昌 330008）

睡眠是人類正常的生理活動，除了可以消除疲勞，使人產(chǎn)生新的活力外，還與提高免疫力、抵抗疾病的能力有著密切的關(guān)系。睡眠障礙通常與身心疾病相關(guān)，會造成疲勞、精神疾病，如抑郁癥等，甚至引起認(rèn)知功能障礙，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降[1]，睡眠障礙還可能會對心臟功能、免疫功能和血糖調(diào)節(jié)產(chǎn)生負(fù)面影響[2]。研究發(fā)現(xiàn)，睡眠障礙會對生殖系統(tǒng)造成一定的影響，可能會造成月經(jīng)不調(diào)、不孕等[3-4]。西醫(yī)主要依靠化學(xué)類藥物進(jìn)行治療，如抗抑郁藥、巴比妥類藥物等[5]，雖然有一定療效，但成癮性高，依賴性強(qiáng)，長期服用還會產(chǎn)生一定的耐藥性或不良反應(yīng)。

蜂王漿是由蜂群中的哺育工蜂的上顎腺等腺體分泌的乳白色或淡黃色乳狀液體，是蜂王幼蟲整個(gè)發(fā)育期和雄蜂幼蟲前期的唯一食物。蜂王漿略帶甜、酸、澀、辛辣味，并具有特殊香氣[6]，其成分非常復(fù)雜，且與蜂種、蜜源、產(chǎn)地、季節(jié)等因素相關(guān)[7-8]。許多研究表明，蜂王漿具有包括促進(jìn)睡眠[9-10]、增強(qiáng)免疫力[11-12]、延緩衰老[13]、修復(fù)細(xì)胞和組織損傷[14-16]、抗氧化[17]、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[18]等在內(nèi)的多種功能活性。有研究推測[9，19]，蜂王漿中的主要活性成分可能包括脂類物質(zhì)如10-羥基-2-癸烯酸、蛋白類物質(zhì)如蜂王漿主蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）以及小分子類物質(zhì)，如維生素、氨基酸等。在MRJPs中，已發(fā)現(xiàn)有9種不同的組分，命名為MRJP1～MRJP9，其中分子量為55 kDa左右的MRJP1，含量最高且被認(rèn)為具有良好的功能活性[20-22]。

對氯苯丙氨酸，又稱芬克洛寧，是色氨酸羥化酶（tryptophan-hydroxylase，TDH）的選擇性和不可逆抑制劑[23]，而 TDH 是 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）合成的限速酶。因此，對氯苯丙氨酸通過抑制色氨酸羥基化而阻斷5-HT的合成，可顯著降低腦內(nèi)和血液中的5-HT濃度，從而引發(fā)失眠。對氯苯丙氨酸多用于動物失眠模型的建立，并被廣泛用于5-HT及其與其他神經(jīng)遞質(zhì)之間關(guān)系的研究[24]。本文以蜂王漿為原料，通過超濾透析、真空冷凍干燥、甲醇-二氯甲烷提取法等方法提取蜂王漿粗蛋白、蛋白類功能因子和脂類功能因子，并通過對氯苯丙氨酸構(gòu)建失眠小鼠模型，結(jié)合睡眠實(shí)驗(yàn)及腦組織和血液中神經(jīng)遞質(zhì)變化，探究蜂王漿及其功能組分提取物對小鼠睡眠質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級KM小鼠（4周齡，雄性，156只，體質(zhì)量16 g～20 g）：湖南斯萊克景達(dá)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2020-0006。

1.1.2 原料與試劑

蜂王漿原漿、江西汪氏蜜蜂園有限公司；褪黑素：湯臣倍健股份有限公司；苯巴比妥鈉：上海上藥新亞藥業(yè)有限公司；對氯苯丙氨酸（4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；10-羥基-2-癸烯酸標(biāo)準(zhǔn)品、對羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、透析膜（8 000 Da～14 000 Da）：上海源葉生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）片劑：生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色譜純）：德國Merck公司；無水乙醇（優(yōu)級純）：西隴科學(xué)股份有限公司；超濾管（截留分子量30 kDa）：美國Millipore公司；酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）測定試劑盒：武漢Elabscience生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204TE/02電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；LYNX4000高速離心機(jī)、ST16R高速離心機(jī)：美國Thermo Fisher Scientific公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PowerPac基礎(chǔ)電泳儀：美國Bio-Rad公司；e2695高效液相色譜儀：美國Waters科技有限公司；1260高效液相色譜儀：美國Agilent科技有限公司；FreeZone真空冷凍干燥機(jī)：美國Labconco公司；N1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社；spectraMAX190全自動酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂王漿中粗蛋白的提取

將蜂王漿原液按料液比1∶9（g/mL）溶于PBS中，在4℃條件下攪拌24 h后于12 000 r/min離心30 min，去除全部上清液，用截留分子量8 000 Da～14 000 Da的透析膜透析24 h后，通過真空冷凍干燥得粗蛋白提取物，使用BCA試劑盒測定提取物的蛋白質(zhì)濃度，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法測定蛋白質(zhì)組成及分子量范圍。

1.3.2 蜂王漿中蛋白類功能因子的提取

試驗(yàn)方案參考文獻(xiàn)[25]，通過超濾透析、冷凍干燥得蛋白類功能因子提取物。使用BCA試劑盒測定提取物的蛋白質(zhì)濃度，并采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法和SDS-PAGE法測定蛋白質(zhì)組成及分子量范圍。

1.3.3 蜂王漿中脂類功能因子的提取

參照文獻(xiàn)[26]的方法，采用二氯甲烷-甲醇法制備得到脂類功能因子提取物。參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 9697—2008《蜂王漿》，通過高效液相色譜法測定提取物中10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）含量。

1.3.4 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

動物實(shí)驗(yàn)參照已有研究[27-29]進(jìn)行優(yōu)化，所有雄性昆明小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下（溫度20°C～26°C，相對濕度40%～70%，白天與黑夜每12 h為一個(gè)循環(huán)）適應(yīng)1周后，開始正式實(shí)驗(yàn)。所有的小鼠隨機(jī)分為13組，每組12只，即空白組（B）、PCPA模型組（M）、褪黑素對照組（ME）、蜂王漿組（RJ）、粗蛋白提取物的低/中/高劑量組（CL/CM/CH）、蛋白類功能因子提取物的低/中/高劑量組（PL/PM/PH）及脂類功能因子提取物的低/中/高劑量組（AL/AM/AH），動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

圖1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig.1 Animal experiment design

實(shí)驗(yàn)期間小鼠可自由飲水?dāng)z食，第1天～2天，除空白組外所有小鼠每天腹腔注射300 mg/kg用弱堿性（pH8.0）生理鹽水配制的PCPA溶液[27]，連續(xù)注射2 d，建立失眠小鼠模型；然后對除空白組外所有小鼠繼續(xù)腹腔注射100 mg/kg PCPA溶液，連續(xù)2 d，鞏固失眠小鼠造模效果，空白組腹腔注射等體積弱堿性生理鹽水。

實(shí)驗(yàn)第3天～7天，對除空白組和PCPA模型組外所有小鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)，每天1次。褪黑素對照組和蜂王漿組參照70 kg體質(zhì)量的成年人每日最佳攝入量換算，褪黑素對照組（ME）小鼠灌胃0.39 mg/kg的褪黑素，蜂王漿組（RJ）小鼠灌胃637 mg/kg的蜂王漿原漿（相當(dāng)于體質(zhì)量70 kg成年人每日攝取4.9 g蜂王漿）；粗蛋白提取物的低/中/高劑量組（CL/CM/CH）小鼠分別灌胃60、120、240 mg/kg的粗蛋白提取物，蛋白類功能因子的低/中/高劑量3組（PL/PM/PH）小鼠分別灌胃44、88、176 mg/kg的蛋白類功能因子，脂類功能因子的低/中/高劑量組（AL/AM/AH）小鼠分別灌胃 13.1、26.2、52.4 mg/kg的脂類功能因子，灌胃體積為每10 g小鼠體質(zhì)量灌胃100 μL，空白組與PCPA模型組小鼠則每天灌胃等體積的蒸餾水。全程監(jiān)控記錄小鼠的體質(zhì)量及精神狀態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集所有小鼠血清、腦組織及肝組織，于-80℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，稱取小鼠腦及肝組織質(zhì)量，通過其與小鼠體質(zhì)量的比值計(jì)算器官指數(shù)。

1.3.5 檢測指標(biāo)

1.3.5.1 改善睡眠實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有研究[30]的方法，稍有改動，具體如下：所有實(shí)驗(yàn)均在溫度適宜、安靜環(huán)境下進(jìn)行。小鼠末次灌胃30 min后給各組小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉，將苯巴比妥鈉注射后至翻正反射消失的時(shí)間記為小鼠睡眠潛伏期，并以翻正反射消失至再次出現(xiàn)的時(shí)間記為小鼠睡眠時(shí)長，觀察各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠時(shí)長的差異。

1.3.5.2 生化指標(biāo)檢測

采用相應(yīng)ELISA試劑盒，根據(jù)說明書，分別測定血清中5-HT、多巴胺（dopamine，DA）以及腦組織中去甲狀腺腎上腺素（norepinephrine，NE）濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism軟件及雙尾T檢驗(yàn)方法，若p值小于0.05則認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂王漿粗蛋白、蛋白類功能因子及脂類功能因子提取物含量及分子量

本試驗(yàn)獲得的蜂王漿粗蛋白中蛋白質(zhì)的相對含量約為79.42%，其中以分子量為50 kDa～60 kDa及35 kDa～45 kDa的蛋白質(zhì)組分為主。蛋白類功能因子提取物中分子量為50 kDa～60 kDa組分的相對含量為93.08%。脂類功能因子提取物中10-HDA的相對含量為43.85%。

2.2 小鼠體質(zhì)量增長率

實(shí)驗(yàn)過程中小鼠體質(zhì)量變化見圖2。

圖2 小鼠實(shí)驗(yàn)中的體質(zhì)量增長率Fig.2 Body weight growth in mouse experiments

如圖2所示，所有小鼠體質(zhì)量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均有不同程度的增加，其中PCPA模型組比空白組小鼠的體質(zhì)量增長率低，粗蛋白提取物高劑量及脂類功能因子低劑量組小鼠的體質(zhì)量增長率趨近于空白組。小鼠體質(zhì)量增長率結(jié)果表明，PCPA給藥造模后的小鼠出現(xiàn)了體質(zhì)量增長減緩的趨勢，但無顯著性差異，說明本實(shí)驗(yàn)PCPA造?？梢阅M中輕度的失眠體征。

2.3 小鼠器官指數(shù)

小鼠腦組織及肝臟的器官指數(shù)見圖3。

圖3 小鼠的腦器官指數(shù)和肝器官指數(shù)Fig.3 Brain organ index and liver organ index in mice

如圖3所示，與空白組比較，PCPA模型組小鼠的腦、肝臟器官指數(shù)均有所增加；脂類功能因子低劑量組小鼠腦、肝臟器官指數(shù)相比模型組均有所減少，趨近于空白組。小鼠器官指數(shù)結(jié)果表明，PCPA造模之后的小鼠出現(xiàn)了各器官指數(shù)上升的趨勢，但無明顯差異，說明本實(shí)驗(yàn)PCPA造模未造成小鼠明顯器質(zhì)性病變；蜂王漿及其各提取物組分對失眠小鼠器官指數(shù)上升表現(xiàn)出恢復(fù)的趨勢，說明了蜂王漿及其各提取物組分的安全性。

2.4 改善睡眠實(shí)驗(yàn)

2.4.1 各組小鼠睡眠潛伏期時(shí)間

各組小鼠睡眠潛伏期時(shí)間見圖4。

圖4 各組小鼠的睡眠潛伏期時(shí)間Fig.4 Sleep latency of mice in each group

如圖4所示，PCPA模型組小鼠睡眠潛伏期時(shí)間相較于空白組有極顯著性差異（p<0.01），說明PCPA建立小鼠失眠模型成功。除蛋白類功能因子低劑量組外，其他組小鼠的睡眠潛伏期都顯著短于PCPA模型組，其中蜂王漿組、粗蛋白低劑量組和脂類高劑量組小鼠的睡眠潛伏期相比其它干預(yù)組更短，與模型組相比，差異高度顯著（p<0.001）。蛋白類功能因子及脂類功能因子組小鼠的睡眠潛伏期隨著干預(yù)劑量的增加表現(xiàn)出遞減的趨勢。

2.4.2 各組小鼠睡眠時(shí)間

各組小鼠睡眠時(shí)間見圖5。

圖5 各組小鼠睡眠時(shí)間Fig.5 Sleep duration of mice in each group

如圖5所示，與空白組比較，PCPA模型組小鼠的平均睡眠時(shí)間減少；蜂王漿組小鼠的平均睡眠時(shí)間得到恢復(fù)，并且脂類功能因子組小鼠的平均睡眠時(shí)間相比模型組和其他干預(yù)組更長，趨近于褪黑素的效果。

2.5 蜂王漿及其提取物對PCPA致失眠小鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

2.5.1 5-羥色胺（5-HT）

各組小鼠血清中5-HT的濃度見圖6。

圖6 各組小鼠血清中5-HT含量Fig.6 Content of 5-hydroxytryptamine(5-HT)in serum of mice in each group

如圖6所示，與空白組相比，PCPA模型組小鼠血清中5-HT濃度極顯著下降（p<0.01）。5-HT是重要的腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)，與認(rèn)知功能、機(jī)體的睡眠和疲勞密切相關(guān)[31-32]，隨著睡眠剝奪時(shí)間延長，進(jìn)入腦內(nèi)的色氨酸增加，5-HT合成也增加，腦內(nèi)5-HT濃度升高，機(jī)體會出現(xiàn)疲勞感和睡意[33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了PCPA作為色氨酸羥化酶抑制劑，能夠阻斷5-HT的合成，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，引起失眠。

經(jīng)過蜂王漿及不同劑量的不同蜂王漿組分干預(yù)后，5-HT濃度均有明顯提高。其中，粗蛋白提取物的低、中劑量，蛋白類功能因子高劑量以及脂類功能因子組小鼠血清中5-HT濃度相對較高（p<0.001）；表明蜂王漿及其提取物可通過調(diào)節(jié)小鼠血清中5-HT濃度，從而達(dá)到改善睡眠的作用。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂類功能因子提取物相比于粗蛋白提取物和蛋白類功能因子提取物，對失眠小鼠的睡眠潛伏期時(shí)間、睡眠時(shí)間及血清中5-HT濃度的改善效果相對更好。除了5-HT，去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）也是與調(diào)節(jié)睡眠相關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，因而后續(xù)通過腦組織中NE和血清中DA的濃度變化，進(jìn)一步探討蜂王漿改善睡眠的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.5.2 去甲腎上腺素（NE）

各組小鼠腦組織中NE的濃度見圖7。

圖7 各組小鼠腦組織中NE濃度Fig.7 Content of norepinephrine(NE)in brain tissue of mice in each group

如圖7所示，PCPA模型組小鼠腦組織NE濃度較空白組顯著上升（p<0.05）。NE負(fù)責(zé)神經(jīng)元之間的溝通，并在注意力、情緒、睡眠等方面扮演重要角色，NE增加可獲得食物能量儲存，并能提高大腦的醒覺度[34-35]。蜂王漿組及脂類功能因子提取物均可下調(diào)小鼠腦組織NE的平均濃度，趨近于空白組，特別是低劑量脂類功能因子的效果最為顯著（p<0.05）。

2.5.3 多巴胺（DA）

各組小鼠血清中DA的濃度見圖8。

圖8 各組小鼠血清中DA含量Fig.8 Content of dopamine(DA)in serum of mice in each group

如圖8所示，PCPA模型組小鼠血清DA濃度較空白組高度顯著降低（p<0.001），DA是第一個(gè)被驗(yàn)證在中樞疲勞中起作用的神經(jīng)遞質(zhì)。研究證實(shí)，PCPA可能會導(dǎo)致血清中的DA顯著降低[36]，并且血清DA缺乏可能與血清素缺乏有關(guān)的情緒問題發(fā)生率呈正相關(guān)[37]。經(jīng)蜂王漿干預(yù)后小鼠血清DA濃度得到極顯著恢復(fù)（p<0.01），脂類功能因子提取物低、中、高劑量均能顯著提高小鼠血清DA濃度，并且呈現(xiàn)出劑量依賴的趨勢。

3 結(jié)論

本研究采用腹腔注射PCPA構(gòu)建睡眠剝奪小鼠模型，研究蜂王漿及其蛋白、脂質(zhì)提取物對睡眠潛伏期、睡眠時(shí)間及神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，蜂王漿原漿、粗蛋白組分、蛋白類功能因子組分及脂類功能因子組分能夠顯著縮短失眠小鼠睡眠潛伏期，上調(diào)5-羥色胺濃度。同時(shí)，脂類功能因子干預(yù)對小鼠睡眠時(shí)間的延長效果最好，并且脂類功能因子干預(yù)還能明顯改善DA及NE濃度異常，對小鼠失眠相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂具有更好的改善作用。

綜上所述，蜂王漿中發(fā)揮促睡眠作用的主要功效成分可能為脂類提取物，蛋白類功能因子能夠發(fā)揮一定的協(xié)同作用。該研究結(jié)果為蜂王漿及其提取物在改善睡眠的作用機(jī)制及其應(yīng)用提供參考依據(jù)。