肥胖小鼠腸道菌群對半乳甘露聚糖的響應(yīng)與篩選

于穎，任昕淼，付曉丹，肖夢詩，程佳瑩，朱常亮，牟海津*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西省生物活性多糖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

半乳甘露聚糖是一種植物來源的異質(zhì)多糖，由甘露糖主鏈和半乳糖側(cè)鏈組成，目前，用于商業(yè)生產(chǎn)的半乳甘露聚糖主要包括瓜爾豆膠、塔拉樹膠和西拉角豆[1-2]。其中瓜爾豆膠在食品領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛，但黏度過高的特點(diǎn)影響了其在體內(nèi)的代謝和作用發(fā)揮，目前，對其降解后的低分子量半乳甘露聚糖（galactomannan polysaccharides，GMPS）功能活性關(guān)注較多。GMPS作為水溶性纖維，可促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，改善腸道微環(huán)境，緩解慢性功能性腸病[3]。其可溶性纖維可形成凝膠，在胃中排空緩慢，使飽腹感增加，在飲食中添加可降低食欲，有助于減肥和預(yù)防肥胖[3-4]。GMPS通過增加膽汁酸的排泄和減少腸肝膽汁酸，促進(jìn)以膽固醇為原料的膽汁酸的形成，從而降低肝游離膽固醇濃度[5]?？固悄虿≡u(píng)估研究表明，GMPS可以誘導(dǎo)餐后胰島素濃度升高，通過改善胰島素抵抗起到抗糖尿病作用[4]。

人類腸道是一個(gè)由1 000多種微生物組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，微生物的數(shù)量級(jí)高達(dá)1014[6]。人類和其共生菌群構(gòu)成了一個(gè)超級(jí)有機(jī)體，腸道菌群是一個(gè)“被忽視的人體器官”[7]。腸道微生物基因組編碼的基因數(shù)量遠(yuǎn)多于人類，因此其具有多種代謝潛力，可以發(fā)酵不易被人體消化的食物，如多糖[8]。在過去的幾十年里，越來越多的研究表明，腸道微生物及其代謝物在肥胖和相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[9]。糞便移植研究表明，轉(zhuǎn)移瘦者的腸道菌群至患有代謝綜合征的肥胖患者中，可提高患者的胰島素敏感性[10]。由此可見，腸道微生物是飲食與人類健康之間的重要樞紐。

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是革蘭氏陽性厭氧微生物，是腸道菌群中最豐富的微生物之一，屬于腸道有益菌[11]?；蚪M學(xué)的分析表明，雙歧桿菌編碼與碳水化合物降解和吸收的基因數(shù)量比大部分腸道微生物更多，這使它們具備較強(qiáng)的代謝復(fù)雜碳水化合物的能力[12]。雙歧桿菌與人體健康息息相關(guān)。研究表明，與健康受試者相比，肥胖或2型糖尿病患者腸道內(nèi)的雙歧桿菌豐度顯著降低[13]。假長雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）是腸道內(nèi)豐度較高的雙歧桿菌，其在各種宿主中的平均相對豐度為13.1%[14]。目前，一些研究已揭露假長雙歧桿菌的益生潛能。已發(fā)現(xiàn)假長雙歧桿菌的干預(yù)可降低高脂飲食小鼠體內(nèi)甘油三酯的水平[15]。假長雙歧桿菌與菠蘿蜜種子來源的抗性淀粉相互作用，顯著降低高脂飲食小鼠的體重和血清脂質(zhì)水平，對小鼠肝脂肪變性有治療作用[16]。但與目前已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用的雙歧桿菌相比，假長雙歧桿菌的功能和性質(zhì)研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。

多糖與腸道菌群的相互作用是其發(fā)揮益生作用的主要機(jī)制，但目前關(guān)于GMPS對肥胖小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)，以及與其高響應(yīng)的腸道微生物研究較少。本研究通過體外模擬腸道環(huán)境的方式，將GMPS與肥胖小鼠糞便共培養(yǎng)，探究其對肥胖小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，并從糞便及培養(yǎng)液中進(jìn)行高響應(yīng)有益菌株的篩選，為新型益生菌和合生元的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常小鼠糞便、肥胖小鼠糞便均來源于中國海洋大學(xué)應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室造模小鼠[17]。

瓜爾豆膠粉：青州榮美爾生物科技股份有限公司；復(fù)合聚糖酶：中國海洋大學(xué)應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制；短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸）、分子量標(biāo)準(zhǔn)品（670、410、150、21、5 kDa的葡聚糖）：美國Sigma Aldrich Chemical公司；SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品（甲酸、乳酸）：日本Tokyo Chemical Industry；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）：上海梯希愛公司。標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純。

0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于800 mL蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）：天根生化科技（北京）有限公司；乳雙歧桿菌M1、植物乳桿菌R1為中國海洋大學(xué)應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

改良的BS培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L肝浸粉、3 g/L牛肉浸粉、5 g/L酵母浸粉、8 g/L胰酪蛋白胨、0.5 g/L 可溶性淀粉、1 g/L NaCl、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.005 g/L MnSO4、0.5 g/L L-半胱氨酸鹽酸鹽、10 g/L GMPS、50 mg/L莫匹羅星鋰鹽（上述試劑為分析純），調(diào)節(jié)pH值為7.2±0.1。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂。培養(yǎng)基配制完成后使用氮吹儀通氮?dú)庖猿?，隨后在高壓蒸汽滅菌鍋中115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

RV-605型雙層玻璃反應(yīng)釜：上海亞榮生化儀器廠；HH.CP-7型恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LAQU Atwin-pH-22型手持pH計(jì)：HORIBA科學(xué)儀器事業(yè)部；DC150型氮吹儀：杭州佑寧儀器有限公司；1260 Infinity高效液相色譜：美國Agilent公司；GeneAmpPCR儀：美國ABI公司；Centrifuge 5430R型高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；FDU-1200型真空冷凍干燥機(jī)：東京理化機(jī)械株式會(huì)社；QuantusTM熒光計(jì)：上海普洛麥格生物制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半乳甘露聚糖的制備

將瓜爾豆膠粉溶解于水中，使用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0左右，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的酶與底物的比值加入復(fù)合聚糖酶，攪拌均勻，以180 r/min在反應(yīng)釜中酶解6 h，酶解溫度55℃。酶解液離心10 000 r/min離心20 min，得到上清液，隨后上清濃縮冷凍干燥得到試驗(yàn)所用GMPS。

1.3.2 半乳甘露聚糖分子量及單糖組成的測定

分子量分布通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定，色譜條件如下：色譜柱為TSKgel G4000PWXL；檢測器為示差檢測器；流速為0.4 mL/min；流動(dòng)相為200 mmol/L NaNO3、10 mmol/L NaH2PO4；柱溫為 25 ℃；進(jìn)樣量為 20 μL。制備樣品單糖組成通過PMP柱前衍生法方法測定[18]，色譜條件如下：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱；檢測器為紫外檢測器（245 nm）；流速為0.8 mL/min；流動(dòng)相為83%KH2PO4（0.05 mol/L，pH6.9）和17%色譜級(jí)乙腈；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.3 糞便的活化及與半乳甘露聚糖共培養(yǎng)

模擬腸道培養(yǎng)基的配制及菌懸液的制備參照文獻(xiàn)[18]。取正常小鼠糞便和肥胖小鼠糞便,置于無菌0.01 mol/L PBS，渦旋振蕩后靜置30 min，取上層菌懸液待用。肥胖小鼠菌懸液分別接種至無GMPS培養(yǎng)基（MC組）及添加10 g/L GMPS的培養(yǎng)基（GMPS組），正常小鼠菌懸液接種至無GMPS培養(yǎng)基（NC組）進(jìn)行對照，均按照體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量進(jìn)行接種，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。

1.3.4 培養(yǎng)液pH值變化與短鏈脂肪酸的測定

培養(yǎng)過程從0 h開始，每隔12 h取樣，用手持pH計(jì)測定其pH值變化。取0、12、48 h樣品，4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液參照文獻(xiàn)[17]測定SCFAs積累水平。色譜條件：色譜柱為KC-811+KC-G 6B；檢測器為紫外檢測器（210 nm）；流速為0.8 mL/min；柱溫為55℃；流動(dòng)相為0.01 g/100 mL磷酸溶液（pH2.1）；進(jìn)樣量為20 μL。每組每個(gè)時(shí)間段取3個(gè)平行進(jìn)行測定。

1.3.5 培養(yǎng)液16S rRNA測序及菌群多樣性分析

取48h培養(yǎng)液菌體沉淀進(jìn)行16SrRNA分析（n=7）。樣品DNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）說明書進(jìn)行操作。提取DNA的純度和完整性分別使用NanoDrop2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測；通過PCR對DNA的16S rRNA基因的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和 806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。將回收純化后的PCR產(chǎn)物用QuantusTM熒光計(jì)進(jìn)行檢測定量，使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建立合格文庫。最終的產(chǎn)物使用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序和分析。對于相似度大于97.0%的樣品Reads，使用Usearch軟件對其進(jìn)行聚類、獲得OTU；使用QIIME2軟件，對樣品α多樣性和β多樣性進(jìn)行評(píng)估，分析樣品內(nèi)物種豐富度、均勻度和多樣性等信息。

1.3.6 雙歧桿菌的初步篩選

從GMPS干預(yù)后的小鼠糞便樣品中篩選雙歧桿菌。樣品接種于改良的BS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。富集菌液在改良的BS固體培養(yǎng)基上多次劃線以得到純化的單菌落。通過革蘭氏染色和果糖-6-磷酸磷酸酮酶（fructose-6-phosphate phosphoketonase，F(xiàn)6PPK）酶活反應(yīng)檢測[19]，其中革蘭氏陽性和F6PPK陽性（F6PPK酶活性反應(yīng)后為紅色）的單菌落初步鑒定為目標(biāo)雙歧桿菌。

1.3.7 篩選菌株的分子鑒定與分型

DNA的提取方法參照1.3.5。以篩選菌株DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得細(xì)菌16SrDNA序列。所用引物為 27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACC TTGTTACGACTT-3'）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序，在 NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中通過BLAST工具進(jìn)行比對分析。同種菌株通過BOXPCR進(jìn)一步分型[20]，并與乳雙歧桿菌M1、植物乳桿菌R1對照，證明分型方法的可信性。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取與篩選菌株相似度高的模式菌株的16S rDNA序列，使用MEGA 7軟件構(gòu)建篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.8 篩選菌株的形態(tài)學(xué)觀察

將過夜培養(yǎng)、經(jīng)篩選得到的雙歧桿菌菌液離心（8 000 r/min，10 min），沉淀菌體用 0.01 mol/L PBS洗滌3次。將菌體通過2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛固定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 17.0對各時(shí)間點(diǎn)或不同組的pH值變化、SCFAs產(chǎn)生量、α多樣性指數(shù)的顯著性差異進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）判斷（Tukey’s檢驗(yàn)）。使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和FDR校正計(jì)算所有組菌群數(shù)據(jù)在門、目和屬水平上的差異。通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐標(biāo)分析（primary coordinate analysis，PCoA）、非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scale analysis，NMDS）反映 β 多樣性分析的差異。*表示差異顯著（p＜0.05）；**表示差異極顯著（p＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 GMPS的分子量分布及單糖組成

制備的GMPS分子量分布見圖1。

圖1 GMPS分子量分布HPLC圖譜Fig.1 HPLC profile of molecular weight distribution of GMPS

制備的GMPS分子量基本在20 kDa以下，其中2 kDa～10 kDa部分占比74.27%。瓜爾豆膠原料具有超高黏度，但經(jīng)過酶解后的樣品黏度基本完全消失，證明本試驗(yàn)采用的復(fù)合聚糖酶具有顯著的底物酶解活力。

GMPS的單糖組成如圖2。

圖2 單糖組成的HPLC圖譜Fig.2 HPLC profile of monosaccharide composition

由圖2可知，GMPS主要含有甘露糖及半乳糖，其摩爾比為1.75∶1，與報(bào)道的瓜爾豆膠單糖組成相似。

2.2 短鏈脂肪酸的產(chǎn)生

混菌培養(yǎng)過程中的pH值變化及SCFAs濃度見圖3。

圖3 糞便體外發(fā)酵過程中pH值及SCFAs積累水平Fig.3 The pH and concentration of SCFAs during the in vitro fecal fermentation

如圖3所示，GMPS可提高培養(yǎng)液中SCFAs積累水平，降低培養(yǎng)液pH值。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，GMPS組SCFAs的濃度逐漸增加。對不同時(shí)間點(diǎn)SCFAs組成分析可發(fā)現(xiàn)，主要產(chǎn)物是甲酸、乙酸、丙酸和乳酸。GMPS組在前期SCFAs產(chǎn)生速度較快，總SCFAs濃度從0 h時(shí)的3.56 mmol/L增加到12 h時(shí)的21.05 mmol/L，到48 h時(shí)增加至27.37 mmol/L。其中，濃度最高的為甲酸和乙酸，在培養(yǎng)至48 h時(shí)濃度可分別達(dá)到9.60 mmol/L和9.66 mmol/L。SCFAs作為菌群產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物，一方面可以通過降低腸道內(nèi)pH值來影響腸道環(huán)境，另一方面可以為結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞供能[21]。乙酸是大多數(shù)腸道微生物代謝多糖的終產(chǎn)物，它與脂肪細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體43結(jié)合后，可以抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、刺激胰高糖素樣肽-1和肽YY的分泌，從而發(fā)揮抑制脂肪累積及抑制食欲的作用[22-23]。丙酸在腸道中可以通過抑制食欲、調(diào)節(jié)腸道糖異生來調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)[24-25]。乳酸是調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)的重要代謝產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)飽腹感以及作為腦-腸軸中的細(xì)胞間信使的作用[26]。

2.3 GMPS對小鼠糞便菌群多樣性的影響

2.3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

從3組（共21個(gè)樣品）中獲得917 620條raw read，質(zhì)控后獲得180 852條有效序列（effective read），其平均長度為426 bp。以97.0%的一致性為條件進(jìn)行聚類，共獲得178 767個(gè)分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）。隨著測序深度的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，這說明測序深度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.3.2 α多樣性和β多樣性分析

圖4為不同分組的α多樣性和β多樣性分析。

圖4 α多樣性和β多樣性分析Fig.4 Effects of GMPS on alpha diversity and beta diversity

α多樣性是物種豐度和多樣性的體現(xiàn)，衡量指標(biāo)包括Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)等[27]。分析結(jié)果表明，GMPS對肥胖小鼠腸道菌群豐富度（Chao1指數(shù)）、多樣性（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)）有顯著影響。與NC組相比，MC組Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)降低，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)升高（p<0.01），說明高脂模型組小鼠菌群豐度降低，多樣性升高。與MC組相比，GMPS的干預(yù)顯著降低了Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)（p<0.01）。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，多糖干預(yù)后會(huì)對腸道菌群的豐富度及多樣性產(chǎn)生影響。Zhang等[28]通過研究菊粉對2型糖尿病小鼠的干預(yù)發(fā)現(xiàn)，菊粉同樣顯著降低了小鼠腸道菌群的Chao1和Shannon指數(shù)（p<0.05）。β多樣性分析一般通過PCA及PCoA等方法反映樣本間的差異性。PCA（圖4e）及 PCoA（圖4f）表明，MC 組與NC組之間菌群結(jié)構(gòu)存在差異，且GMPS干預(yù)后改變了肥胖小鼠糞便菌群組成，并區(qū)別于MC組?；讦露鄻有缘腘MDS顯示，NC組與MC組、NC組與GMPS的樣品分布沒有重疊，MC組與GMPS組存在小部分重疊，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果（圖4g）。

2.3.3 GMPS對腸道菌群組成的影響

2.3.3.1 對門、目、屬水平的影響

為進(jìn)一步分析GMPS對肥胖小鼠腸道菌群的影響，分別在門、目、屬水平上分析了各組小鼠腸道菌群的變化，如圖5所示。

圖5 GMPS干預(yù)對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of GMPS on the intestinal microbial composition

在門水平上檢測到4種菌群（圖5a）：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門 （Bacteroidets）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。MC組與GMPS組中厚壁菌門均表現(xiàn)出較高的相對豐度。與NC組相比，MC組擬桿菌門相對豐度降低，GMPS處理則進(jìn)一步降低了擬桿菌門豐度（p<0.05）。目前，厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值常被用作腸道菌群失衡的標(biāo)志。大多數(shù)研究認(rèn)為，諸如糖尿病等代謝紊亂疾病，其患者體內(nèi)擬桿菌門豐度低而厚壁菌門豐度較高[29]。但也有研究表明，糖尿病患者腸道菌群中厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門豐度升高，而且豐度的變化和血糖濃度有關(guān)[30]。與MC組相比，GMPS組的變形菌門相對豐度降低（p<0.05）；而放線菌門相對豐度顯著提高，由1.11%增加至6.27%（p<0.01）。典型的有益菌如雙歧桿菌，是放線菌門的重要成員。而變形菌門常被認(rèn)為有致病性，其分類下包含較多產(chǎn)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的微生物，而LPS是促進(jìn)肥胖產(chǎn)生的機(jī)制之一[8]。

在目水平上，不同組別表現(xiàn)出明顯的菌群結(jié)構(gòu)差異（圖5b）。NC組優(yōu)勢菌為擬桿菌目（Bacteroidales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）和乳桿菌目（Lactobacillales）。MC 組優(yōu)勢菌為梭菌目（Clostridiales）、腸桿菌目、擬桿菌目等。GMPS組優(yōu)勢菌為乳桿菌目、腸桿菌目、雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）。同樣，在屬水平上，不同組別菌群結(jié)構(gòu)差異明顯（圖5c）。NC組優(yōu)勢菌為擬桿菌屬（Bacteroides）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）。MC組優(yōu)勢菌為大腸桿菌屬（Escherichia）、梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬。GMPS組優(yōu)勢菌為腸球菌屬、大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。與NC組相比，MC組擬桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬相對豐度顯著降低，梭菌屬、腸球菌屬相對豐度顯著升高（p<0.01）。而GMPS處理后，提高了腸球菌屬、雙歧桿菌屬相對豐度，降低了副桿菌屬（Parabacteroides）、梭菌屬、氣單胞菌屬（Aeromonas）、摩氏根菌屬（Morganella）的相對豐度（p<0.01）。

研究表明，在肥胖機(jī)體中雙歧桿菌屬、腸球菌屬的豐度降低[25]。雙歧桿菌是目前廣泛研究并應(yīng)用的腸道有益菌，基因組中存在豐富的編碼碳水化合物活性酶及專門的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)雜碳水化合物的相關(guān)基因，具有優(yōu)秀的多糖降解能力。不少研究已揭示了雙歧桿菌與肥胖的關(guān)系。肥胖或超重兒童較高的體重指數(shù)與他們腸道內(nèi)雙歧桿菌豐度的減少有關(guān)[31]。滅活的長雙歧桿菌可改善肥胖糖尿病小鼠的血糖異常并減輕脂肪組織的重量[32]。在隨機(jī)雙盲實(shí)驗(yàn)中，雙歧桿菌的施用改善了日本健康成年人的內(nèi)臟脂肪堆積[33]。腸球菌作為乳酸菌中廣泛應(yīng)用于食品、微生態(tài)制劑和飼料添加劑中的益生菌，可以調(diào)整腸道菌群平衡，抑制致病菌黏附定植，調(diào)節(jié)宿主免疫[34]。本研究結(jié)果表明，GMPS干預(yù)可以使有益的腸球菌和雙歧桿菌的豐度升高，并降低條件致病菌如Aeromonas、Morganella的豐度。

2.3.3.2 組間差異性分析

LEfSe（LDA＞4.0）以及Anova方差分析結(jié)果見圖6、表1。

圖6 各組菌群豐度的差異性分析Fig.6 Differential analysis of abundance in each group

表1 各組菌群豐度的Anova方差分析Table 1 Anova analysis of abundance in each group

由圖6可知，NC組差異顯著的分類群主要屬于擬桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬；MC組為梭菌屬、擬桿菌屬、副擬桿菌屬、氣單胞菌屬、摩根氏菌屬；GMPS組為腸球菌屬、大腸桿菌屬及雙歧桿菌屬。結(jié)合Anova方差分析（表1），在種水平豐度上NC組有顯著優(yōu)勢的為單形擬桿菌（B.uniformis）、陰溝腸桿菌（E.cloacae）、格氏乳球菌（L.garvieae）；MC組為拜氏梭菌（C.beijerinckii）；GMPS 組中假長雙歧桿菌（B.pseudolongum）則為優(yōu)勢菌。由上述結(jié)果可推斷，在小鼠腸道菌群中，假長雙歧桿菌是對GMPS高響應(yīng)的菌株。目前，關(guān)于假長雙歧桿菌的研究表明，除具有改善肥胖的作用外，在Dong等[35]研究新生兒黃疸與腸道菌群的關(guān)系實(shí)驗(yàn)中，同樣發(fā)現(xiàn)假長雙歧桿菌相對豐度的增加與黃疸風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)。在臨床前的實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤模型中，假長雙歧桿菌的代謝產(chǎn)物肌苷可通過特異性激活輔助性T淋巴細(xì)胞1細(xì)胞，增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的治療效果，最終明顯縮小腫瘤模型體積[36]。此外，特定種類功能性碳水化合物如阿拉伯木聚糖、甘露低聚糖、低聚果糖、抗性淀粉等都可選擇性地促進(jìn)腸道內(nèi)假長雙歧桿菌豐度的升高[37-40]。低聚果糖和單月桂酸甘油酯已被證明能夠改善炎癥、肥胖和代謝紊亂，且這種改善同腸道中假長雙歧桿菌豐度的升高呈正相關(guān)[41-42]。

續(xù)表1 各組菌群豐度的Anova方差分析Continue table 1 Anova analysis of abundance in each group

2.3.4 功能預(yù)測分析

京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路功能預(yù)測結(jié)果見圖7。

圖7 KEGG功能差異柱形圖Fig.7 Difference of KEGG function

如圖7所示，與NC組相比，MC組腸道菌群的脂質(zhì)代謝（lipid metabolism）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）及多糖生物合成和代謝（glycan biosynthesis and metabolism）等代謝通路中功能基因豐度降低。GMPS的干預(yù)升高了碳水化合物代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、核苷酸代謝等相關(guān)功能基因的豐度，推測GMPS干預(yù)能夠恢復(fù)腸道菌群對碳水化合物的代謝能力進(jìn)一步調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)。

2.4 雙歧桿菌的篩選與形態(tài)分析

通過BS培養(yǎng)基篩選得到98個(gè)單菌落，革蘭氏染色觀察和F6PPK酶活檢測篩選出76個(gè)革蘭氏陽性且F6PPK酶活陽性的菌株。將76株菌株進(jìn)行16S rDNA比對鑒定，結(jié)果見圖8。

圖8 篩選菌株的分子鑒定Fig.8 Molecular identification of selected strains

由圖8可知，這些菌株與假長雙歧桿菌存在最高的相似度（≥99%）。其中有26株成功鑒定為假長雙歧桿菌，命名為YY-1至YY-26。將上述26株菌進(jìn)行BOX-PCR分型，結(jié)果如圖8a所示，根據(jù)電泳條帶的圖譜，判斷主要有5株不同的假長雙歧桿菌。將其構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖8b所示，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這5株菌的進(jìn)化關(guān)系非常接近，與B.pseudolongum PNG-209G之間具有高度相似性，在發(fā)育關(guān)系中較密切。以上結(jié)果證明，所篩選菌株均為假長雙歧桿菌，證實(shí)了菌群多樣性的分析結(jié)果。GMPS與假長雙歧桿菌之間良好的互作關(guān)系也是后續(xù)研究值得挖掘的切入點(diǎn)。

篩選得到的假長雙歧桿菌菌株的典型形態(tài)如圖9所示。

圖9 所篩選的假長雙歧桿菌菌株的典型形態(tài)Fig.9 Cellular morphology of selected B.pseudolongum by scanning electron microscope

由圖9可知，菌株呈桿狀，菌體長度不一，大部分為短桿狀，長度范圍1.5 μm～3.0 μm。細(xì)胞有輕微的彎曲，部分中間膨大，兩頭較尖，大多聚集在一起或成對出現(xiàn)。

3 結(jié)論

本研究將瓜爾豆膠酶解后制備得到的GMPS干預(yù)肥胖小鼠腸道菌群后，選擇性地促進(jìn)了對其利用能力較強(qiáng)的腸道微生物的生長。與正常小鼠相比，肥胖小鼠腸道菌群梭菌屬相對豐度增加，擬桿菌屬、乳球菌屬相對豐度降低，而GMPS的干預(yù)可降低肥胖小鼠腸道菌群中梭菌屬及條件致病菌氣單胞菌、摩氏根菌屬的豐度，并增加乳酸產(chǎn)生菌腸球菌和雙歧桿菌的豐度，證明GMPS的干預(yù)有望對肥胖小鼠腸道微生態(tài)紊亂產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。而且，GMPS干預(yù)后導(dǎo)致糞便中假長雙歧桿菌豐度大幅上升并成為優(yōu)勢菌群之一，表明假長雙歧桿菌對GMPS具有高度響應(yīng)性；假長雙歧桿菌豐度的增加很可能與GMPS緩解肥胖導(dǎo)致的腸道微生態(tài)紊亂有密切關(guān)系。目前，盡管有關(guān)假長雙歧桿菌的益生和降血脂等功能已有初步研究，但其調(diào)控肥胖機(jī)體的腸道微生態(tài)的機(jī)制尚不清楚，與半乳甘露聚糖等非消化性碳水化合物之間的互作機(jī)制也缺乏系統(tǒng)研究。因此，本研究為假長雙歧桿菌與益生元的互作研究提供新的視角，并為新型合生元產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。