貓杯狀病毒分離株VP1基因序列與致病性分析

劉 健，白藝蘭，李 鑫，桂亞萍，鞠厚斌，龔國華，夏爐明，陳偉鋒，朱曉英，常曉靜，李增強，唐聰圣，王 建，趙洪進(jìn)

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

貓杯狀病毒(feline calicivirus，F(xiàn)CV)屬于杯狀病毒科、水皰疹病毒屬，是一種引起貓科動物口腔與上呼吸道疾病的重要病原。FCV呈世界性分布，在貓科動物中具有高度傳染性，貓及老虎、獵豹等野生貓科動物均易感。FCV主要臨床癥狀表現(xiàn)為鼻炎、結(jié)膜炎、急性口腔潰、肺炎、慢性胃炎和跛行等。近年來，由于FCV高度的變異性產(chǎn)生的強毒株可引起嚴(yán)重、急性、致死性全身性疾病，死亡率高達(dá)50%，癥狀可表現(xiàn)為潰瘍性皮炎、急性關(guān)節(jié)炎、腸炎、流產(chǎn)以及跛行等全身感染，對貓及貓科動物造成嚴(yán)重威脅。

FCV全基因組由3個開放性閱讀框(open reading frame，ORF)組成，其中，ORF2基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白1，按功能域ORF2又可劃分為A、B、C、D、E和F 6個區(qū)。C和E區(qū)變異性較大，特別是E區(qū)包含鑒別VS-FCV的特征性氨基酸突變位點，變異最為明顯，也是早期疫苗免疫失敗的重要原因。為了進(jìn)一步了解FCV在上海地區(qū)流行狀況及其遺傳變異和演化方向，本研究從2021年1月—3月，從上海地區(qū)上呼吸道癥狀貓的病料中分離鑒定得到13株FCV，對其1基因進(jìn)行遺傳演化分析，豐富了國內(nèi)FCV分離株的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為該病毒強毒株的篩選和疫苗研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

從上海市中心城區(qū)寵物醫(yī)院收集了17份具有上呼吸道癥狀患貓的眼結(jié)膜、口咽和鼻黏膜拭子樣品，記錄患貓的年齡、貓三聯(lián)滅活疫苗免疫情況、主要臨床癥狀(表1)。將采集的拭子加2 mL PBS緩沖液浸泡后，用0.22 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 臨床樣品采集的詳細(xì)信息Table 1 Details of the clinical samples

1.2 細(xì)胞和主要試劑

F81細(xì)胞(貓腎傳代細(xì)胞)由上海市動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實驗室保存。貓三聯(lián)滅活疫苗(貓鼻氣管炎、嵌杯病毒病、泛白細(xì)胞減少癥)(批號：D286389A)購自碩騰(上海)企業(yè)管理有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(批號：2126865)、0.25%濃度胰酶消化液(批號：2042303)均購自GIBCO公司；胎牛血清(批號：2418)購自Sigma公司；核酸提取試劑盒(批號：MDII14-01)購自Magen公司；PrimeScriptRT-PCR Kit(批號：AJ62323A)、LA PCRKit Ver.2.1(批號：AK5301)、Prime ScriptOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)(批號：AKE0559A)購自寶生物工程(大連)公司；貓皰疹病毒1型熒光PCR檢測試劑盒(批號：FHV20210504)、貓細(xì)小病毒熒光PCR檢測試劑盒(批號：FPV20210604)購自上海爾創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 病料的RT-PCR鑒定

吸取50 μL上述處理的樣品，貓三聯(lián)滅活疫苗作陽性對照，陰性拭子作陰性對照，提取總RNA，依據(jù)參照文獻(xiàn)[6]合成引物：上游引物FCV-JCF：5′-GCCTCAAACATTAGGAGTGC-3′；下游引物FCV-JCR：5′-CCCTGGGGTTAGGCGCAG-3′，擴(kuò)增片段為420 bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將出現(xiàn)預(yù)期目的片段的RT-PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行比對分析，確認(rèn)是否為FCV基因序列。同時將FCV陽性的樣本接種F81細(xì)胞，進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)。

1.4 病毒分離

F81細(xì)胞常規(guī)消化傳代，待長成單層且貼壁率達(dá)到90%時，將細(xì)胞按照1∶3的比例消化傳代，同時將上述病料同步接種到細(xì)胞中，37 ℃，5% CO濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每6 h觀察細(xì)胞病變1次，70%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變、圓縮和脫落時，將培養(yǎng)液凍融3次，收集細(xì)胞上清。

1.5 病毒鑒定

1.5.1 FCV1基因的擴(kuò)增 依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]合成FCV1基因全長擴(kuò)增引物，F(xiàn)CV-VP1上游引物：5′-ATGTGCTCAACCTGCGC-3′；FCV-VP1下游引物：5′-TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT-3′。FCV1基因序列全長2 007～2 010 bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。體系總體積為50 μL：PrimeScriptRT-PCR Kit buffer 25 μL，Enzyme Mix 2 μL，上、下游引物(濃度均為10 μmol·L)各1 μL，RNA模板1 μL，雙蒸水補至50 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 保存。取5 μL RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性RT-PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行比對分析，確認(rèn)是否為FCV的1基因序列。

1.5.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離病毒株第3代培養(yǎng)物接種F81細(xì)胞，待70%細(xì)胞出現(xiàn)CPE后反復(fù)凍融3次收毒，將收獲的細(xì)胞液凍融3次后，10 000 r·min離心1 h，除去細(xì)胞碎片，隨后上清液與終濃度為10%的聚乙二醇8000(PEG8000)混合過夜。在4 ℃下12 000 r·min離心2 h后，用Tris緩沖鹽溶液(TBS)重懸，經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.5.3 外源病毒檢測 對13株分離株進(jìn)行貓皰疹病毒1型(FHV-1)和貓細(xì)小病毒(FPV)兩種外源病毒檢測。根據(jù)貓皰疹病毒1型熒光PCR檢測試劑盒和貓細(xì)小病毒熒光PCR檢測試劑盒要求，對分離病毒株第3代培養(yǎng)物進(jìn)行FHV-1和FPV熒光PCR檢測。

1.6 構(gòu)建遺傳演化樹

分別參照國內(nèi)外FCV強毒株、經(jīng)典株和疫苗株1基因序列(表2)，利用MEGA 6.0和DNAStar v7.1軟件構(gòu)建FCV1基因遺傳演化分析樹，并分析其序列特征。

表2 FCV VP1參考序列Table 2 Reference strains of FCV VP1 gene

1.7 分離致病性試驗

1.7.1 分離株有限稀釋純化 將FCV-SH202101和FCV-SH202113分離病毒株第3代培養(yǎng)物用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行10倍的倍比稀釋，共稀釋11個稀釋度，將稀釋液與消化好的細(xì)胞懸液按照體積比1∶3加入至6孔板中，第12孔加細(xì)胞懸液作陰性對照，每孔體積為2 mL。37 ℃，5% CO濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每6 h觀察細(xì)胞病變1次。待70%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變、圓縮和脫落時，收獲出現(xiàn)細(xì)胞病變的最大稀釋度孔的上清進(jìn)行二次有限稀釋純化，共稀釋純化6次，測定純化后病毒液的TCID，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 攻毒試驗 將6只健康中華田園貓(3只2～3月齡幼貓，3只2歲左右成年貓，均未免疫過貓三聯(lián)滅活疫苗)分為A組、B組和對照組，每組均為2只，包括1只幼貓和1只成年貓。A和B 組貓均采用滴鼻和口服方式分別接種10TCID·mL的FCV-SH202101和10TCID·mL的FCV-SH202113分離株病毒液，接種劑量為滴鼻和口服各1 mL·只；對照組貓接種相同劑量的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。不同感染組隔離飼養(yǎng)，自由采食、飲水，每日監(jiān)測貓的臨床癥狀和死亡情況，同時采集眼、口、鼻拭子用于排毒情況的檢測。

2 結(jié) 果

2.1 病料的RT-PCR檢測

17份病料經(jīng)FCV RT-PCR擴(kuò)增，其中，編號為BD20210104-2～BD20210104-8、BD20210112-1、BD20210127-1、BD20210804-1、BD20210804-3～BD20210804-5的13份樣品擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測顯示，在420 bp左右出現(xiàn)與預(yù)期目的產(chǎn)物大小一致的目的條帶，部分病料樣品的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4. RT-PCR陽性病料樣本；5～8. RT-PCR陰性病料樣本；9. 陽性對照；10. 陰性對照M. DL2000 DNA marker; 1-4. RT-PCR positive samples; 5-8. RT-PCR negative samples; 9. Positive control; 10. Negative control圖1 部分病料FCV RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 FCV RT-PCR detecting results of part samples

將13份樣品的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，確認(rèn)13個序列均為FCV的基因序列，表明13份樣品均為FCV陽性。

2.2 陽性病料接種F81細(xì)胞

13份FCV陽性病料接種F81細(xì)胞，盲傳3代，第3代細(xì)胞培養(yǎng)物接種F81細(xì)胞24 h，均產(chǎn)生CPE，細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、拉絲、聚集現(xiàn)象，然后脫落、漂浮在細(xì)胞維持液中(圖2)。

A.接種BD20210104-2第3代細(xì)胞培養(yǎng)物的F81細(xì)胞；B.陰性對照A. F81cells inoculated the 3rd generation cell culture of BD20210104-2; B. Negative control圖2 接種BD20210104-2第3代細(xì)胞培養(yǎng)物24 h后F81細(xì)胞病變結(jié)果Fig.2 CPE of the 3rd generation cell culture of BD20210104-2 in F81 cells at 24 h

2.3 FCV VP1基因的擴(kuò)增

將13份病毒上清液提取RNA，進(jìn)行FCV1 RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到約2 000 bp大小的條帶，與預(yù)期2 007 bp大小一致(圖3)。測序結(jié)果拼接后，得到13株FCV的1全基因序列，將13株病毒1基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，確認(rèn)13株序列均為FCV的1基因序列，表明13株分離株為FCV，分別命名為FCV-SH202101～FCV-SH202113。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～13. FCV VP1 RT- PCR陽性產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker; 1-13. FCV VP1 RT- PCR positive products圖3 FCV VP1 RT-PCR結(jié)果Fig.3 FCV VP1 RT-PCR detecting results

2.4 形態(tài)學(xué)觀察

FCV-SH202101株F81細(xì)胞第4代培養(yǎng)物經(jīng)電鏡負(fù)染觀察可見無囊膜，呈圓形、橢圓形等形態(tài)，直徑30～40 nm的病毒粒子(圖4)，與杯狀病毒粒子形態(tài)特征相符，表明分離株病毒為FCV。

圖4 FCV-SH202101病毒粒子電鏡圖Fig.4 Electron microscopy image of isolated FCV-SH202101 strain

2.5 分離株外源病毒檢測

對13株FCV分離株進(jìn)行FHV-1和FPV兩種外源病毒熒光PCR檢測，結(jié)果均為陰性。

2.6 FCV VP1同源性及遺傳演化分析

2.6.1 分離株與國內(nèi)外參考株1基因同源性及遺傳演化分析 將13株FCV分離株與國內(nèi)外參考株1基因進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，13株上海分離株之間的核苷酸序列相似性為74.3%～99.8%，其中，F(xiàn)CV-SH202103株與FCV-SH202104株相似性最高，為99.8%；FCV-SH202108株與 FCV-SH202111株相似性最低，為74.3%。與國內(nèi)外強毒株相似性為73.8%～82.9%，其中，F(xiàn)CV-SH202113株與FCV-5株相似性最高，為82.9%；與國內(nèi)外經(jīng)典株相似性為73.4%～80.1%，氨基酸序列分析顯示，F(xiàn)CV-SH202102株與FCV-YH-16株的相似性高達(dá)91.9%，F(xiàn)CV-SH202108株與FB-NJ-13株的相似性最低，為82.1%；與疫苗株相似性為73.2%～79.8%，氨基酸相似性FCV-SH202103株與F4株高達(dá)89.4%，F(xiàn)CV-SH202102株與F4株最低，為82.7%。

遺傳演化樹分析顯示，13株分離株分布于3個分支，F(xiàn)CV-SH202108株與上海分離株SH/2014遺傳關(guān)系較近，F(xiàn)CV-SH202103、FCV-SH202104和FCV-SH202112遺傳關(guān)系較近，與國外參考株和疫苗株處于同一分支；FCV-SH202113株與強毒株FCV-5遺傳關(guān)系較近，處于同一分支；其余毒株與國內(nèi)參考株處于同一分支，且FCV-SH202101、FCV-SH202102、FCV-SH202106、FCV-SH202107、FCV-SH202109和FCV-SH202110遺傳關(guān)系較近(圖5)。

▲表示分離毒株▲stands for isolated strain圖5 分離株與參考株VP1基因序列遺傳演化樹Fig.5 Maximum-likelihood tree based on VP1 gene of isolated strains and reference strains

2.6.2 VS-FCV特征性氨基酸分析 以部分E區(qū)(426—461 aa)分析的具有VS-FCV突變特征氨基酸位點為依據(jù)，確定430、438、443、448、452、455和458為VS-FCV特征性氨基酸位點(圖6)。結(jié)果表明5株分離株與VS-FCV有6個位點吻合，7株分離株有5個位點吻合，1株分離株有4個位點吻合(表3)。

表3 FCV VP1蛋白部分E區(qū)強毒株特征性氨基酸位點分析Table 3 VS-FCV characteristic amino acid sites analysis of partical E region in VP1 protein

圖6 VP1蛋白部分E區(qū)的氨基酸比較圖Fig.6 Comparison of amino acid sequences of partical E region in VP1 protein

2.7 分離株致病性試驗

2.7.1 病毒液TCID的測定 測定FCV-SH202101株和FCV-SH202113株細(xì)胞半數(shù)感染量分別為10和10TCID·mL。

2.7.2 感染貓的臨床癥狀 FCV202101株和FCV2021131株感染中華田園貓后，48 h內(nèi)幼貓陸續(xù)出現(xiàn)杯狀病毒上呼吸道癥狀，如眼屎增多、氣喘、咳嗽等，體溫最高升至39.5 ℃，5 d后幼貓均瀕臨死亡。A組成年貓1周后出現(xiàn)眼屎增多現(xiàn)象，11 d后貓瀕臨死亡；B組成年貓1周后無明顯的臨床癥狀，2周后出現(xiàn)臨床癥狀，精神沉郁、不食、發(fā)燒、眼屎大量增多，18 d后死亡。

2.7.3 感染貓的排毒情況 每日采集不同感染組貓的眼、鼻、口拭子，利用RT-PCR方法檢測其排毒情況(表4)，結(jié)果表明，F(xiàn)CV202101株和FCV2021131株感染貓3 d后，可持續(xù)從眼、鼻、口拭子中檢測到FCV。

表4 貓感染FCV后排毒情況Table 4 Virus shedding of cats after FCV infection

2.7.4 感染貓的發(fā)病與死亡情況 FCV202015株和FCV202031株感染貓后，均可導(dǎo)致試驗貓的發(fā)病和死亡(圖7)，對幼貓具有較強的致死性，且病程短、發(fā)病急，對成年貓也具有致死性，但病程長短不一。

圖7 試驗組貓感染FCV后存活率Fig.7 Survival rate of cats after FCV infection

3 討 論

近年來，隨著國民生活水平的逐步提高，上海市貓寵呈逐年上升趨勢，已逐漸成為寵物市場的主流。在貓的傳染病病例中，貓杯狀病毒感染病例占1/3以上。本研究對17例呼吸道癥狀的貓病例進(jìn)行貓杯狀病毒的分離，經(jīng)過細(xì)胞病變、1測序、病毒電鏡觀察，13株分離株都鑒定為FCV，陽性率達(dá)到76.47%，與周孟云等在杭州寵物貓中調(diào)查的結(jié)果基本一致，表明上海市具有呼吸道癥狀的寵物貓杯狀病毒感染比較普遍。

由于FCV的RNA聚合酶缺乏校正功能，導(dǎo)致其基因組頻繁變異，當(dāng)出現(xiàn)VS-FCV時，就可能導(dǎo)致疫苗失去保護(hù)力。美國的Pedersen等首次報道在1998年采集的樣品中發(fā)現(xiàn)了VS-FCV，2003年英國及2009年法國也暴發(fā)過疫苗免疫的成年貓感染VS-FCV，2013年Velasco等報道了西班牙暴發(fā)VS-FCV，2018年郭慧敏等首次報道了VS-FCV在我國流行。上海地區(qū)13株FCV分離株之間的1核苷酸序列相似性為74.3%～99.8%，與國內(nèi)外參考株的核苷酸序列相似性為73.2%～80.1%，氨基酸相似性82.7%～91.9%，其中與疫苗株的核苷酸相似性只有73.2%～79.8%，氨基酸的相似性為82.7%～89.4%，分離株1核苷酸序列和氨基酸序列相似性均不高，符合FCV易突變的特征。遺傳演化樹顯示，2株分離株與強毒株處于同一分支，8株分離株與國內(nèi)經(jīng)典株處于同一分支，3株分離株與國外經(jīng)典株親緣關(guān)系較近，研究表明，上海市主要流行株可能來自國內(nèi)北方地區(qū)，少數(shù)毒株來自國外，與劉春國等研究結(jié)果一致，表明上海市FCV起源于不同祖先，其遺傳存在生物多樣性。雖然Smith等認(rèn)為FCV-F9疫苗株仍然能夠預(yù)防FCV的感染，但是遺傳演化樹顯示，本市分離株與疫苗株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是當(dāng)前疫苗對貓的免疫效果不佳的主要原因。

分離株與國內(nèi)強毒株SH2014(Shanghai)株相似性為74.7%～77.4%，與國外強毒株相似性為73.8%～82.9%。分離株與強毒株同源性雖然不一致，但是僅從核苷酸和氨基酸序列同源性上并不能將經(jīng)典FCV與VS-FCV株區(qū)分出來。遺傳演化樹顯示，F(xiàn)CV-SH202108株和FCV-SH202113株與強毒株遺傳關(guān)系較近，其中，F(xiàn)CV-SH202113株與FCV-5處于同一分支，F(xiàn)CV-SH202108株雖然與經(jīng)典株LS015處于同一分支，但同時與強毒株FCV-George Walder、FCV-Jengo、FCV-Kaos、UTCVM-H1、SH2014(Shanghai)、UTCVM-H2遺傳關(guān)系較近，表明FCV-SH202108和FCV-SH202113株具有強毒株的可能。FCV1衣殼蛋白可分為A、B、C、D、E和F等6個區(qū)，其中E為超變區(qū)，有研究發(fā)現(xiàn)VS-FCV具有特征性氨基酸位點，F(xiàn)oley等對E區(qū)具有VS-FCV突變特征的氨基酸位點進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，430位、438位、443位、448位、452位、455位和458位aa可能與其致病性相關(guān)。對E區(qū)中7個可能的強毒株特征性氨基酸位點分析，發(fā)現(xiàn)FCV-SH202101、FCV-SH202102、FCV-SH202107、FCV-SH202109和FCV-SH202110株有6個氨基酸位點與已公開VS-FCV株吻合，而已報道的廣西株只有一個吻合位點。因此FCV-SH202101、FCV-SH202102、FCV-SH202107、FCV-SH202109和FCV-SH202110株也具有強毒株的可能。

從采樣宿主臨床癥狀、1進(jìn)化樹和VS-FCV特征性氨基酸位點進(jìn)行分析，選擇FCV-SH202101株和FCV-SH202113株進(jìn)行動物感染試驗，研究表明，F(xiàn)CV-SH202101株和FCV-SH202113株感染中華田園貓后均可導(dǎo)致發(fā)病和死亡，病毒的潛伏期為1～2 d，接種后第3天即可檢測出排毒，不同年齡段貓的病程不一致，幼貓5 d后可導(dǎo)致死亡，成年貓病程可持續(xù)11～18 d，說明FCV-SH202101株和FCV-SH202113株可能為VS-FCV中國分離株，但VS-FCV的確診還需要進(jìn)一步研究病毒復(fù)制病例各臟器FCV的分布和滴度、病理變化以及可否造成感染貓的群體性發(fā)病與死亡等。

4 結(jié) 論

本研究從臨床呼吸道癥狀貓分離到13株能在F81上形成CPE的病毒，經(jīng)測序和電鏡觀察鑒定為FCV，1序列分析表明上海地區(qū)FCV流行株主要來自國內(nèi)北方地區(qū)，少數(shù)毒株來自國外地區(qū)，動物感染試驗表明2株FCV具有VS-FCV致病性特征，為VS-FCV毒株的篩選提供了有力的證據(jù)，也為FCV疫苗的研究提供了技術(shù)支持。