低蛋白日糧補充天冬氨酸對斷奶至育肥階段豬生長性能及肉品質(zhì)性狀的影響

關(guān) 鵬，王晨昱，胡 鮮，何流琴，李建中，李鐵軍

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 動物腸道功能湖南省重點實驗室，長沙 410081；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙 410125；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

我國飼用蛋白質(zhì)資源嚴重匱乏以及大宗非糧蛋白資源利用率極低，嚴重制約了我國飼料業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展。大力開發(fā)低蛋白飼糧配制技術(shù)是提高蛋白原料利用率，節(jié)約飼料資源和降低養(yǎng)殖成本的重要方法。美國NRC(2012)營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)中仔豬、生長豬以及育肥豬配合飼料粗蛋白(crude protein，CP)需要推薦量分別是20%、18%和16%， 而低蛋白日糧是指在不影響生長性能的前提下按NRC推薦標(biāo)準(zhǔn)降低2～4個百分點的日糧。目前，對低蛋白日糧的研究大多只關(guān)注平衡必需氨基酸，卻忽略了低蛋白日糧也可能導(dǎo)致非必需氨基酸失衡，從而降低豬生長性能。天冬氨酸(aspartate，Asp)又稱天門冬氨酸，雖傳統(tǒng)營養(yǎng)學(xué)中被認為是非必需氨基酸，但其處于糖酵解、嘌呤嘧啶合成等代謝的中間樞紐位置，故在代謝中屬于功能性氨基酸。其除了可參與機體蛋白質(zhì)合成外，在能量代謝、免疫和抗氧化應(yīng)激等方面都發(fā)揮著重要作用。有研究表明，Asp能通過改變回腸末端微生物的菌群區(qū)系，進而影響豬的脂肪代謝。也有研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加0.5%或1.0%Asp可提高腸道乳糖酶和蔗糖酶活性，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，進而反轉(zhuǎn)因脂多糖引起的斷奶仔豬生長性能下降。但在實踐生產(chǎn)中，本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加1.0%的Asp不影響斷奶仔豬的生長性能，但低蛋白日糧條件下添加0.5%Asp對斷奶至育肥階段豬生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率和肉品質(zhì)性狀影響的研究尚無報道。因此，本研究通過探討低蛋白日糧添加0.5%Asp對其生長性能、血液生理生化指標(biāo)、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和肉品質(zhì)性狀的影響，以期為低蛋白日糧非必需氨基酸的添加水平及飼糧的精準(zhǔn)配制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

-天冬氨酸(純度≥98%)購于張家港市思普生化有限公司?；A(chǔ)日糧購自長沙粒豐飼料科技有限公司，三元雜交(杜洛克×長白×大約克)斷奶仔豬購于湖南龍華農(nóng)牧發(fā)展有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選取20頭平均體重為(10.93±0.79) kg的健康三元雜交(杜洛克×長白×大約克)斷奶仔豬，隨機分成兩組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，仔豬全部單欄飼養(yǎng)。試驗周期共分為3個階段：斷奶階段、生長階段、育肥階段，為期84 d。在斷奶、生長、育肥階段，對照組(Con)分別飼喂粗蛋白質(zhì)含量為17%、15%、13%的玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，試驗組(Asp)飼喂在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%天冬氨酸的試驗飼糧。天冬氨酸采用取代部分玉米原料的方式添加，非額外添加?；A(chǔ)日糧參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)進行配制，基礎(chǔ)日糧的組成及營養(yǎng)水平見表1，基礎(chǔ)日糧中不添加抗生素和防霉劑。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物樓進行，仔豬采用不銹鋼單欄飼養(yǎng)。斷奶、生長與育肥階段均自由采食與飲水。每天準(zhǔn)確記錄每只豬的采食量與健康狀況，并按照豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理程序?qū)ψ胸i進行其他飼養(yǎng)管理與免疫，定時進行豬舍的消毒與清掃，保持豬舍清潔與通風(fēng)。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 生長性能 準(zhǔn)確記錄各組試驗豬的采食量，計算每頭豬的平均日采食量(ADFI)，并于試驗第1、28、63和84天，以欄為單位空腹稱重，計算每頭豬的平均日增重(ADG), 根據(jù)豬的ADFI和ADG計算料重比(F/G)。

1.4.2 血清生化指標(biāo) 分別于試驗第28、63和84天，各組試驗豬空腹12 h后，進行前腔靜脈采血。并在4 ℃、3 000 r·min條件下離心15 min制備血清。于-20 ℃冰箱中凍存。用于血清生化指標(biāo)和血清游離氨基酸含量檢測。

血清中的總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(serum albumin, ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine amino transferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(serum aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、尿素氮(serum urea nitrogen, BUN)、葡萄糖(glucose, GLU)、血氨(serum ammonia)含量采用CX4型全自動生化分析儀 (美國Backman公司)進行檢測，試驗操作均按相應(yīng)試劑盒說明進行。

1.4.3 血清游離氨基酸 吸取約2 mL樣品于離心試管中，3 000 r·min離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液1 mL于另外的離心試管中，加入8%磺基水楊酸1 mL，混勻，靜置15 min，離心過后取下層水相，過0.22 μm濾膜后裝入上樣瓶存于4 ℃，用氨基酸分析儀(L-8900，日本) 測定游離氨基酸的含量。

1.4.4 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率 分別于育肥階段試驗結(jié)束前3 d，以欄為單位進行糞便收集，固定收糞時間為每天下午3點，連收3 d，采用鹽酸不溶灰分(AIA)作為內(nèi)源指示劑測定粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、粗纖維(CF)表觀消化率。

養(yǎng)分表觀消化率(%) =100-(飼糧中AIA含量/糞中AIA含量)×(糞中養(yǎng)分含量/飼糧中養(yǎng)分含量)×100。

1.4.5 肉品質(zhì)性狀 屠宰后的胴體沿背中線分開，左半部分用于肉品質(zhì)分析，參照NY/T 821—2004《豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范》相關(guān)方法測定背最長肌的pH、肉色等胴體品質(zhì)指標(biāo)。

1.4.6 實時熒光定量 使用TRIzol試劑從背肌組織中分離出總RNA。分離的RNA用Nano Drop 2000c分光光度計(Thermo，美國)測定RNA濃度和穩(wěn)定性。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國)合成了第一條cDNA鏈。每一個樣本用SYBR-Green實時PCR系統(tǒng)進行3次評估。PCR程序如下：95 ℃ 5 min，在95 ℃下擴增45個循環(huán)10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，擴增檢測慢速氧化型肌纖維(1)、快速氧化型肌纖維(2a)、快速酵解型肌纖維(2b)、中間型肌纖維(2x)和內(nèi)參(-)的表達。使用2方法計算相對表達。引物如表2所示。

表2 本試驗所用引物序列Table 2 The sequence of primers used in this study

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Excel 2010進行試驗數(shù)據(jù)整理，并用SPSS 22.0軟件進行獨立樣本檢驗。以<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 低蛋白日糧添加Asp對豬在斷奶至育肥階段生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，斷奶階段，試驗組ADG較對照組提高了15.69%(<0.05)， F/G極顯著降低了17.03%(<0.01)，ADFI無顯著差異(>0.05)；生長階段與育肥階段，試驗組與對照組相比，ADFI、ADG、F/G均無顯著差異(>0.05)。斷奶至育肥階段生豬飼喂補充0.5%Asp的低蛋白日糧，從整體效果來看，對其生長性能無顯著影響。

表3 低蛋白日糧添加Asp對豬斷奶、生長、育肥階段生長性能的影響Table 3 Effect of low-protein diet supplemented with Asp on growth performance of pigs during weaning, growing and fattening stages

2.2 低蛋白日糧添加 Asp對豬在斷奶至育肥階段血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，斷奶階段，與對照組相比，試驗組斷奶仔豬血清ALB和ALP顯著升高(<0.05)，分別升高了30.19%和33.64%，但對 TP、ALT、AST等無顯著影響(>0.05)；生長階段與育肥階段，與對照組相比，試驗組血清ALB、ALP、TP、ALT、AST等均無顯著差異(>0.05)。

表4 低蛋白日糧添加Asp對豬在斷奶、生長、肥育階段的血液生化的影響Table 4 Effect of low-protein diet supplemented with Asp on blood biochemical indexes of pigs during weaning, growing and fattening stages

2.3 低蛋白日糧添加Asp對豬在斷奶至育肥階段血清游離氨基酸含量的影響

由圖1可知，斷奶階段，與對照組相比，試驗組斷奶仔豬血清Pro、Met、Phe和Thr含量顯著降低(<0.05)，分別降低了35.49%、47.66%、22.64%和23.66%。試驗組斷奶仔豬血清Asp、His和Tyr極顯著低于對照組(<0.01), 分別降低了26.93%、48.42%和50.41%。與對照組相比，試驗組斷奶仔豬血清氨態(tài)氮和Lys極顯著升高(<0.01)，分別提高了34.13%和57.30%。生長階段，與對照組相比，試驗組生長豬血清中Asp和Lys含量顯著低于對照組(<0.05)，分別降低了25.33%和20.63%；試驗組生長豬血清氨態(tài)氮含量極顯著降低了19.74% (<0.01)。育肥階段，試驗組與對照組相比，血清Asp和Thr含量顯著降低(<0.05)，分別降低了29.10%和30.33%。

*. 表示存在顯著性差異(P<0.05)；**. 表示存在極顯著性差異(P<0.01)。下圖同*. Indicates that there is significant difference (P<0.05); **. Indicates that there is extremely significant difference (P<0.01). The same as below圖1 低蛋白日糧添加Asp對豬斷奶、生長、育肥階段的血清游離氨基酸的影響Fig.1 Effects of low-protein diet supplemented with Asp on serum free amino acids of pigs during weaning, growing and fattening stages

2.4 低蛋白日糧添加Asp對豬在育肥階段養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表5可知，與對照組相比，育肥豬總能、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和粗纖維表觀消化率極顯著升高(<0.01)，分別升高了3.08%、4.69%、4.07%、21.50%和38.35%。

表5 低蛋白日糧添加Asp對育肥豬養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 5 Effects of low-protein diet supplemented with Asp on nutrient apparent digestibility of fattening pigs %

2.5 低蛋白日糧添加Asp對豬在育肥階段肉品質(zhì)的影響

由表6可知，屠宰后45 min，試驗組肉色與pH較對照組均無顯著差異(>0.05)；屠宰后24 h，與對照組相比，試驗組肉色、pH、剪切力均無顯著差異(>0.05)，但試驗組熟肉率極顯著提高了6.49% (<0.01)。

表6 低蛋白日糧添加Asp對育肥豬肉品質(zhì)的影響Table 6 Effect of low-protein diet supplemented with Asp on meat quality of fattening pigs

2.6 低蛋白日糧添加Asp對豬在育肥階段肌纖維分子mRNA相對表達量的影響

由圖2可知，與對照組相比，試驗組1的mRNA的相對表達量顯著提高了57%(<0.05)，2a、2b和2x等mRNA的相對表達量無顯著差異(>0.05)。

圖2 低蛋白日糧添加Asp對育肥豬肌纖維分子相對表達量的影響Fig.2 Effects of low-protein diet supplemented with Asp on molecular relative expression of muscle fiber in fattening pigs

3 討 論

3.1 低蛋白日糧添加Asp對豬在斷奶至育肥階段生長性能和血液生化指標(biāo)的影響

以玉米-豆粕為基礎(chǔ)并通過平衡Lys、Met、Thr和Trp等氨基酸的低蛋白豬飼料，目前在豬養(yǎng)殖中已成功應(yīng)用。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低蛋白日糧添加0.5%Asp對豬在生長和育肥階段的生長性能無顯著影響，但能夠有效改善其在斷奶階段的平均日增重和料重比。提示豬在斷奶階段對Asp的需求增加，低蛋白日糧不足以滿足其正常的營養(yǎng)需求。這可能是因為Asp作為一種功能性氨基酸，在低蛋白日糧條件下添加Asp可促進仔豬機體能量、蛋白質(zhì)等代謝，改善腸道功能，進而有效緩解仔豬斷奶應(yīng)激和提高免疫力，而生長肥育階段豬已適應(yīng)環(huán)境，體內(nèi)合成的Asp足以滿足正常需求，故對其生長性能無顯著影響。同時，本試驗結(jié)果也與石海峰和段杰林研究結(jié)果一致，表明斷奶仔豬在免疫或氧化應(yīng)激條件下，日糧添加0.5%或1%的Asp可有效改善仔豬生長性能。眾所周知，血清中TP和ALB指標(biāo)能夠反映機體蛋白質(zhì)代謝和免疫力情況，血清中TP含量升高，則表明機體蛋白質(zhì)合成增加，血清ALB能夠清除自由基，同時能夠保護機體免疫系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白日糧中添加0.5%Asp能夠顯著提高豬在斷奶階段血清中的ALB和TP含量，但對生長和肥育階段無顯著影響，這也進一步說明低蛋白日糧添加Asp可提高斷奶階段生長性能的原因。Asp不僅可以促進血清中免疫指標(biāo)的升高，也有研究表明Asp可以作為中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，并且，Asp還能夠參與巨噬細胞中精氨酸-NO循環(huán)，促進細胞中NO的生成，能夠增強機體抗微生物和有害細胞的能力，這也可能是Asp能通過改善仔豬免疫力，從而改善仔豬生長性能的原因。

3.2 低蛋白日糧添加Asp對血清游離氨基酸含量及營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

動物機體氨基酸代謝和蛋白質(zhì)沉積情況可通過血清游離氨基酸的變化得到體現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白日糧添加0.5%Asp可顯著降低豬在斷奶、生長、育肥階段血清中Asp的含量，表明低蛋白情況下，Asp能夠促進豬機體對血清游離Asp的利用率，可更好地維持豬生長過程中腸道的發(fā)育及能量狀態(tài)；Pro和Thr能夠阻止淋巴細胞的凋亡，并促進抗體的產(chǎn)生，本研究證實，低蛋白日糧添加0.5%Asp極顯著降低了斷奶仔豬血清中Pro的含量，并顯著降低了斷奶仔豬和育肥豬血清Thr水平，表明添加Asp有利于促進斷奶仔豬和育肥豬血清中Pro和Thr的利用，改善機體免疫狀態(tài)；Lys是豬第一限制性氨基酸，其不僅能夠進入三羧酸循環(huán)，為蛋白質(zhì)合成供能，并參與機體酶、骨骼肌和一些激素的合成，Met屬于含硫氨基酸，其代謝物不僅在緩解氧化應(yīng)激發(fā)面發(fā)揮重要作用，還能為機體蛋白質(zhì)和核酸甲?；峁┘谆岣叩鞍谆钚?，在本試驗中，日糧添加Asp極顯著提高了斷奶仔豬血清中Lys含量，并使Met含量顯著降低，表明在低蛋白情況下，日糧添加0.5%Asp有利于斷奶仔豬的蛋白沉積。眾所周知，豆粕中含有的抗胰蛋白酶、尿毒酶等能夠破壞小腸結(jié)構(gòu)進而影響飼料的消化吸收，低蛋白氨基酸平衡日糧更加有利于豬對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，胡琴等研究表明，低蛋白日糧能夠有效提高育肥豬干物質(zhì)和粗脂肪消化率，本研究也獲得類似結(jié)果，同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)低蛋白日糧添加0.5%Asp可顯著提高育肥豬總能、粗蛋白等表觀消化率。本試驗結(jié)果表明，低蛋白日糧添加0.5%Asp可提高全程飼養(yǎng)(育肥豬)血清中氨基酸利用率和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，這可能與Asp能夠提高腸黏膜中二糖酶的活性和調(diào)節(jié)腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體的表達相關(guān)，對于育肥階段養(yǎng)分表觀消化率提高，生長性能卻沒有顯著改變，可能與豬在此階段對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率不充分有關(guān)，但其具體原因，仍需要進一步研究。

3.3 低蛋白日糧添加Asp對豬在育肥階段肉品質(zhì)和肌纖維相關(guān)基因mRNA表達量的影響

育肥豬的肉質(zhì)性狀受到多種因素調(diào)節(jié)，其中肌纖維類型對肉品的pH、肉色、嫩度、肌內(nèi)脂肪含量等具有重要的影響。豬的肌纖維在代謝上可分為慢速氧化型(1)、快速氧化型(2a)、快速酵解型(2b)和中間型(2x)等4種類型。研究表明，蛋白水平影響肌纖維類型的組成，飼喂低蛋白日糧的豬具有更高比例的氧化型肌纖維，氧化型肌纖維脂質(zhì)含量更高，其中慢速氧化型(1)有利于增加豬肉的嫩度與多汁性，本研究也獲得類似結(jié)果，在低蛋白條件下，全程飼喂0.5%Asp可顯著提高1的mRNA表達量，并顯著提高了肉品熟肉率；而熟肉率、系水力能夠體現(xiàn)肉品的多汁性，這也進一步說明低蛋白日糧添加0.5%Asp能夠增加肉品的多汁性。低蛋白日糧添加0.5%Asp對肉品質(zhì)具有一定改善作用，其原因可能與Asp能夠促進肌纖維向1型肌纖維轉(zhuǎn)化有關(guān)，通過改變肌纖維的類型來調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪含量；其次，Asp還可能通過調(diào)節(jié)脂肪細胞中脂質(zhì)的合成和分解來調(diào)節(jié)脂肪含量。研究表明，Asp能夠改善腸道微生物的豐度，腸道微生物及其代謝物可通過與腸上皮細胞G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合調(diào)控宿主機體的代謝反應(yīng)，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)沉積，還有研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸通過與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合能夠調(diào)節(jié)脂肪的生成與分解，從而能夠影響脂肪的沉積，這可能也是Asp能夠改善肉質(zhì)的一個重要原因。

4 結(jié) 論

斷奶至育肥階段豬全期飼喂添加0.5%Asp的低蛋白日糧，僅對斷奶階段仔豬生長性能具有改善作用；但通過全期飼喂，低蛋白日糧補充0.5%Asp卻可提高營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，促進血清氨基酸利用率，并通過提高1的mRNA表達量改善肉品熟肉率，有利于改善肉品質(zhì)性狀。