不同產(chǎn)地蒼術(shù)種子中總黃酮和多酚的含量測定及比較

陳克克，馬 婷，高雨萌，鐘莉莉，文曉杰，胡李華

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院; 西安市秦嶺天然產(chǎn)物開發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;西安文理學(xué)院 基因工程實(shí)驗(yàn)室，西安 710065；2. 留壩縣秦健特色產(chǎn)業(yè)有限公司，陜西 漢中 724100；3. 西安文理學(xué)院 衛(wèi)生所，西安 710065)

北蒼術(shù) (Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.) 屬于菊科蒼術(shù)屬植物，是藥材蒼術(shù)的基源物種之一，以其干燥根莖入藥．北蒼術(shù)主產(chǎn)于陜西、山西、遼寧、吉林、黑龍江、河北、河南、內(nèi)蒙古、甘肅等地[1-2]，陜西為其道地產(chǎn)區(qū)，特別是我省秦嶺地區(qū)為蒼術(shù)的適生地．藥材蒼術(shù)是我國常用大宗藥材，具有抗菌、抗炎、抗心律失常、抗腫瘤、抗?jié)?、降血壓等作用[3-7]，主要用于治療脘腹脹滿、濕阻中焦、風(fēng)寒感冒、泄瀉、風(fēng)濕痹痛、腳氣痿蹙等病癥．國內(nèi)外對蒼術(shù)的相關(guān)研究表明，蒼術(shù)藥理活性的發(fā)揮與其富含的化學(xué)成分密切相關(guān)．研究發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)富含揮發(fā)油、萜類物質(zhì)、甾醇類、多糖類、有機(jī)酸類等化學(xué)成分．但是，目前關(guān)于蒼術(shù)化學(xué)成分的研究主要集中在揮發(fā)油方面，而關(guān)于蒼術(shù)黃酮類和多酚類物質(zhì)的研究還很欠缺．

黃酮類和多酚類物質(zhì)是廣泛分布于中藥材體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，因?yàn)榫哂歇?dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)而表現(xiàn)出豐富多樣的藥理活性，逐漸成為國內(nèi)外天然產(chǎn)物研究開發(fā)和利用的熱點(diǎn)．現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類和多酚類物質(zhì)具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗心腦血管疾病和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，已經(jīng)在藥物、食品和化妝品等行業(yè)有了一定的應(yīng)用．黃酮類和多酚類物質(zhì)已經(jīng)成為判定中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要成分，受到了科研工作者的日益重視．

目前，尚未見研究蒼術(shù)黃酮類物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道，而關(guān)于蒼術(shù)多酚類物質(zhì)的研究文獻(xiàn)亦較少．隨著對蒼術(shù)資源開發(fā)力度的增大，同時(shí)考慮到黃酮類和多酚類物質(zhì)對現(xiàn)代藥理學(xué)的重要作用，本實(shí)驗(yàn)收集了陜西寶雞和漢中兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的蒼術(shù)種子，測定并比較了兩個(gè)不同產(chǎn)地蒼術(shù)種子樣品中總黃酮和多酚的含量，為進(jìn)一步開發(fā)利用陜西省蒼術(shù)植物資源奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蒼術(shù)種子，分別采集自陜西省寶雞市和漢中市．將蒼術(shù)種子先洗凈烘干，再用粉碎機(jī)粉碎，然后過40目孔徑篩，收集篩下的粉末備用．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒼術(shù)種子樣品溶液的提取

在10 g蒼術(shù)種子粉末中加入60%乙醇溶液100 mL，于搖床中30 ℃振蕩提取24 h，布氏漏斗過濾后收集續(xù)濾液即為蒼術(shù)種子提取液，將提取液保存于4 ℃冰箱備用．

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁在105 ℃烘干至恒重，精確稱取60.0 mg，先用少量甲醇溶解，再定容至250 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.24 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液．

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參考文獻(xiàn)《鐮形棘豆總黃酮和總酚的含量測定》[8]中相對應(yīng)的制備方法進(jìn)行．在6支25 mL棕色容量瓶中先依次精密加入上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 mL，再依次加入去離子水6.0 mL，5%NaNO2試劑1.0 mL，顛倒搖勻后避光靜置6分鐘，隨后加入10% Al(NO3)3試劑1.0 mL，顛倒搖勻后避光靜置反應(yīng)6分鐘后再依次加入1 mol/L的NaOH溶液10 mL終止反應(yīng)，最后用去離子水定容至刻度．用第1支容量瓶中的溶液為空白對照，采用分光光度計(jì)于510 nm波長處依次測定吸光度值，記錄數(shù)值后采用Excel計(jì)算出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和吸光度間的回歸方程．

1.2.3 樣品總黃酮含量的測定

取0.5 mL樣品提取液，按照“1.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”方法進(jìn)行樣品總黃酮的含量測定，平行重復(fù)3次，以吸光度的平均值代入回歸方程求得樣品提取液中總黃酮的含量并進(jìn)而計(jì)算出蒼術(shù)種子中總黃酮的含量．

1.2.4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸在105 ℃烘干至恒重，精確稱取26 mg，用甲醇溶解并定容到100 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.26 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液．

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參考文獻(xiàn)《鐮形棘豆總黃酮和總酚的含量測定》[8]中相對應(yīng)的制備方法進(jìn)行．在6支25 mL棕色容量瓶中先依次精密加入上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.4、0.5、0.6和0.8 mL，再依次加入去離子水10.0 mL，然后分別加入Folin-Ciocalteu顯色劑2.0 mL，充分顛倒混勻，避光靜置8分鐘，隨后加入15% Na2CO3試劑2.0 mL，顛倒搖勻后避光靜置反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用去離子水定容至刻度．以第1支容量瓶中的溶液為空白對照，采用分光光度計(jì)于765 nm波長處依次測定吸光度值，記錄數(shù)值后采用Excel計(jì)算出沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和吸光度間的回歸方程．

1.2.5 樣品多酚含量的測定

取0.8 mL樣品提取液，按照“1.2.4沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”方法進(jìn)行樣品多酚含量的測定，平行重復(fù)3次，以吸光度的平均值代入回歸方程求得樣品提取液中多酚的含量并進(jìn)而計(jì)算出蒼術(shù)種子中多酚的含量．

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL)制作橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光度值制作縱坐標(biāo)，得到蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，見圖1．由結(jié)果可知，蘆丁的濃度在4.8～ 57.6 μg/mL區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，判定系數(shù)R2=0.999 3，回歸方程為y=13.294x-0.010 6．

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL)制作橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光度值制作縱坐標(biāo)，得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，見圖2．由結(jié)果可知沒食子酸的濃度于1.04～8.32 μg/mL區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，判定系數(shù)R2=0.998 5，回歸方程為y=128.23x+0.014 2．

圖2 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品總黃酮含量的測定結(jié)果

依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品算出的回歸方程推導(dǎo)求得兩個(gè)產(chǎn)地蒼術(shù)種子樣品中的總黃酮含量，結(jié)果見表1．由結(jié)果可知，寶雞產(chǎn)蒼術(shù)種子中的總黃酮含量比漢中產(chǎn)蒼術(shù)種子中的低，低了0.86 mg/g，兩者總黃酮含量無顯著性差別．

表1 樣品總黃酮含量的測定結(jié)果

2.4 樣品多酚含量的測定結(jié)果

依據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品算出的回歸方程推導(dǎo)求得兩個(gè)產(chǎn)地蒼術(shù)種子樣品中的多酚含量，結(jié)果見表2．由結(jié)果可知，寶雞產(chǎn)蒼術(shù)種子中的多酚含量比漢中產(chǎn)蒼術(shù)種子中的高，高了2.03 mg/g，但是兩者多酚含量無顯著性差別．

3 結(jié)論

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和Folin-Ciocalteu分光光度計(jì)法分別是定量測定植物材料中總黃酮和多酚含量的典型方法．NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度計(jì)法利用黃酮類物質(zhì)與NaNO2和Al(NO3)3等溶液在堿性條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有顏色的物質(zhì)，通過分光光度計(jì)檢測建立起吸光度值和對應(yīng)濃度之間的線性關(guān)系，從而獲得樣品中總黃酮的含量．Folin-Ciocalteu分光光度計(jì)法的測定原理是，多酚類物質(zhì)可以在堿性條件下還原鎢鉬酸從而生成藍(lán)色的絡(luò)合物，藍(lán)色的深淺和多酚類物質(zhì)的含量呈正比，通過分光光度計(jì)測定出藍(lán)色物質(zhì)的深淺從而計(jì)算出多酚的含量．本實(shí)驗(yàn)采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和Folin-Ciocalteu分光光度計(jì)法首次測定并比較了兩個(gè)產(chǎn)地來源的蒼術(shù)種子中的總黃酮和多酚含量．結(jié)果表明，兩個(gè)產(chǎn)地之間的總黃酮、多酚含量相近，但是同一產(chǎn)地中的多酚含量顯著高于總黃酮含量，高了1倍左右．

黃酮類化合物廣泛存在于中草藥的各個(gè)部位，是中草藥中含量十分豐富的一類多酚類化合物．黃酮類化合物和多酚類化合物因具有重要的藥用價(jià)值而引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注．查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，包括黃酮類化合物在內(nèi)的各類中草藥成分大多為植物的次生代謝產(chǎn)物，會(huì)因其所處生長環(huán)境、氣候、地形、降水、光照等因子的影響而表現(xiàn)出一定的地域性和差異性．例如，因?yàn)槭墚?dāng)?shù)鬲?dú)特氣候的影響，茅山地區(qū)生產(chǎn)的蒼術(shù)其所含的揮發(fā)油的組成成分不同于其他產(chǎn)區(qū)[9]，該結(jié)果提示，蒼術(shù)種子中的總黃酮、多酚含量也可能受到產(chǎn)地生境的影響．從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，寶雞和漢中兩個(gè)產(chǎn)地的蒼術(shù)種子中的總黃酮、多酚含量受生長環(huán)境、氣候等影響而有差異，但是差異并不顯著，因此需要我們后期結(jié)合生境、氣候等因子和黃酮類化合物、多酚類化合物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，尋找差異不顯著的可能原因，揭示化學(xué)成分與環(huán)境的相關(guān)關(guān)系．

蒼術(shù)在陜西植物資源豐富，具有廣闊的發(fā)展前景，本實(shí)驗(yàn)為蒼術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了重要的科學(xué)依據(jù)．