非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)及抗褐化探究

陳小強(qiáng)， 李 紅， 鄒明偉， 郭瑞超， 王宏鵬， 次爾甲瑪， 謝曉東(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 天津 300384)

非洲紫羅蘭(Saintpauliaionantha)是苦苣苔科非洲紫苣苔屬的多年生草本植物，又名非洲堇。非洲紫羅蘭的花和葉均具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值，是良好的裝飾花卉[1]，常規(guī)繁殖方法多采用播種法和葉插法，但用這些方法生產(chǎn)的商品苗繁殖系數(shù)低，品質(zhì)較差，不能滿足新品種推廣的需求[2]。因此，需要為非洲紫羅蘭尋求一種高效穩(wěn)定的繁殖育種方法。植物組織培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)非洲紫羅蘭的快速繁殖，能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量成品苗，其后代能穩(wěn)定保持母株的優(yōu)良性狀，為工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

近年來，關(guān)于非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)技術(shù)的研究逐漸增多，但國內(nèi)對(duì)非洲紫羅蘭抗褐化方面的研究依舊較少[3]。使用抗褐化劑能抑制多酚氧化酶反應(yīng)并減少負(fù)責(zé)抗氧化活性的酚類物質(zhì)損失[4]，優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境。有研究表明抗壞血酸的自氧化特性可有效防止多酚化合物的氧化[5]。因此，使用抗褐化劑可以有效防止試管苗褐變，優(yōu)化培養(yǎng)條件，前景十分可觀。

本試驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究不同碳源、植物激素和抗褐化劑對(duì)非洲紫羅蘭試管苗組織培養(yǎng)的影響，優(yōu)化非洲紫羅蘭增殖和生根的培養(yǎng)條件，可為工廠化育苗奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)非洲紫羅蘭的良種快繁有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以天津農(nóng)學(xué)院植物細(xì)胞工程研究中心生長良好的非洲紫羅蘭試管苗作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1非洲紫羅蘭試管苗的增殖培養(yǎng)

增殖試驗(yàn)采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素為不同種類的碳源、抗褐化劑和不同植物激素配比，各因素隨機(jī)排列(表1)，空白處理為MS培養(yǎng)基+蔗糖20 g/L+瓊脂6 g/L。

表1 非洲紫羅蘭試管苗增殖正交設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design of proliferation of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

1.2.2非洲紫羅蘭試管苗的生根培養(yǎng)

生根試驗(yàn)采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素為蔗糖濃度、抗褐化劑和不同種類的生長素，試驗(yàn)采取完全隨機(jī)設(shè)計(jì)(表2)，空白處理為1/2 MS培養(yǎng)基+蔗糖20 g/L+瓊脂6 g/L。

表2 非洲紫羅蘭試管苗生根正交設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal design of rooting experiment for Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

1.2.3培養(yǎng)條件

接種后將試管苗置于天津農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，光照2 000 lx，光照時(shí)間16 h/d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

褐化率(%)=(褐化葉芽數(shù)/試管苗總?cè)~芽數(shù))×100%；

增殖系數(shù)=增殖后總?cè)~芽數(shù)/接種葉芽數(shù)；

生根率(%)=(生根的試管苗數(shù)/試管苗總株數(shù))×100%；

平均生根數(shù)(條/株)=∑試管苗的生根數(shù)/試管苗總株數(shù)；

平均根長(cm)=∑試管苗的根長/試管苗的生根數(shù)；

褐化評(píng)價(jià)：∑單瓶褐化評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)/5；

褐化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：無褐化0，輕微褐化0～1，中度褐化1～2，嚴(yán)重褐化2～3。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理記錄，使用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析，Minitab 17軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的直觀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 非洲紫羅蘭試管苗增殖研究

非洲紫羅蘭試管苗增殖正交試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，3種試驗(yàn)因素對(duì)非洲紫羅蘭試管苗增殖系數(shù)的影響表現(xiàn)為植物激素>碳源>抗褐化劑，對(duì)試管苗褐化率的影響表現(xiàn)為抗氧化劑>植物激素>碳源，這說明植物激素為影響試管苗增殖系數(shù)的主要因素，且抗褐化劑對(duì)試管苗增殖系數(shù)影響最小，對(duì)褐化的表現(xiàn)影響最大。極差分析結(jié)果可知，本試驗(yàn)中非洲紫羅蘭試管苗增殖最優(yōu)處理為MS+蔗糖20 mg/L+抗壞血酸100 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L。以增殖系數(shù)X和褐化率Y作為因變量進(jìn)行方差分析(表4)。結(jié)果表明不同植物激素對(duì)非洲紫羅蘭試管苗增殖的影響達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。

表3 非洲紫羅蘭試管苗增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 3 Orthogonal test results and range analysis of proliferation of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

表4 非洲紫羅蘭試管苗增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test result for proliferation of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

2.2 非洲紫羅蘭試管苗生根研究

由表5的試驗(yàn)結(jié)果可知，試驗(yàn)因素對(duì)3種生根指標(biāo)(生根率、平均生根數(shù)和平均根長)有不同程度的影響，其中植物激素對(duì)非洲紫羅蘭試管苗的生根效果影響最大。抗褐化劑對(duì)非洲紫羅蘭試管苗生根效率的影響非常小，但對(duì)抗褐化效果的影響較大。結(jié)合極差分析，綜合考慮3種生根指標(biāo)，非洲紫羅蘭試管苗生根最優(yōu)處理為蔗糖20 g/L+檸檬酸100 mg/L+IBA 0.2 mg/L。

表5 非洲紫羅蘭試管苗生根正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 5 Orthogonal test results and range analysis of rooting of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

褐化控制方面，試驗(yàn)結(jié)果表明，抗褐化劑對(duì)非洲紫羅蘭試管苗生根效率的影響非常小，使用檸檬酸和PVP的抗褐化效果要優(yōu)于AC，且試驗(yàn)因素對(duì)抗褐化效果的影響表現(xiàn)為抗褐化劑>植物激素>蔗糖濃度，這說明選用合適的抗褐化劑能明顯改善非洲紫羅蘭試管苗的生根條件。結(jié)合極差分析，非洲紫羅蘭試管苗生根最優(yōu)處理為蔗糖20 g/L+檸檬酸100 mg/L+IBA 0.2 mg/L，生根率為100%，平均生根率為4.1%，平均根長為0.31cm，褐化評(píng)價(jià)為0。理論最優(yōu)處理實(shí)際效果差于處理6。綜上，非洲紫羅蘭最優(yōu)培養(yǎng)基為處理6(蔗糖20 g/L+檸檬酸100 mg/L+NAA 0.2 mg/L)。

方差分析結(jié)果(表6)表明，蔗糖濃度對(duì)平均根長的影響存在顯著差異(p<0.05)，植物激素對(duì)生根率和平均生根數(shù)的影響存在顯著差異(p<0.05)。

表6 非洲紫羅蘭試管苗生根正交試驗(yàn)因變量P, N, L, E方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test dependent variables P, N, L, E for rooting of Saintpaulia ionantha seedlings in vitro

3 討論與結(jié)論

3.1 非洲紫羅蘭試管苗增殖研究

耿明清[6]的研究中，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L為非洲紫羅蘭增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基，且表明過量或不足的激素添加比例均會(huì)劣化非洲紫羅蘭的增殖

效果。本試驗(yàn)中，不同比值的植物激素配方對(duì)非洲紫羅蘭試管苗增殖有顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，非洲紫羅蘭試管苗在有6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L的3個(gè)處理中增殖系數(shù)均超過2.28，增殖芽最多。

同用抗壞血酸作為抗褐化劑的處理5和處理8雖然褐化率較低，但試管苗長勢(shì)較差。究其原理，抗壞血酸是一種酚氧化酶抑制物，它可以將該酶的二價(jià)銅離子還原成一價(jià)銅離子[7]。上述現(xiàn)象可能是由于抗壞血酸與培養(yǎng)基中的酚類物質(zhì)作用后的反應(yīng)產(chǎn)物抑制了試管苗增殖，或是該試驗(yàn)中抗壞血酸劑量過大對(duì)非洲紫羅蘭試管苗產(chǎn)生了毒害作用[8]。與抗壞血酸相比，使用半胱氨酸和檸檬酸作為抗褐化劑的處理組褐化率普遍偏低，且處理1和處理8并不存在褐化現(xiàn)象。結(jié)合極差分析和方差分析，將施加相同劑量的半胱氨酸和檸檬酸的處理結(jié)果做對(duì)比，施加檸檬酸的抗褐化表現(xiàn)更好，因此本試驗(yàn)選取檸檬酸為非洲紫羅蘭試管苗增殖誘導(dǎo)最優(yōu)抗褐化劑。

碳源對(duì)增殖系數(shù)和褐化率的影響較小，其中使用蔗糖20 g/L作為碳源的處理8和處理9增殖系數(shù)均超過了2.27，且褐化程度較低，故選取蔗糖為最優(yōu)碳源。

綜上，本試驗(yàn)中非洲紫羅蘭試管苗增殖誘導(dǎo)最優(yōu)處理為MS+蔗糖20 mg/L+抗壞血酸100 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L。

3.2 非洲紫羅蘭試管苗生根研究

耿明清等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1/2 MS+IBA 0.2 mg/L為最優(yōu)生根培養(yǎng)方案。而楊晨星[9]和呂德任[10]的研究發(fā)現(xiàn)，非洲紫羅蘭最佳生根激素均為0.2 mg/L NAA。這說明，同濃度下(0.2 mg/L)的NAA和IBA均有作為非洲紫羅蘭生根誘導(dǎo)最優(yōu)生長激素的潛力。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，非洲紫羅蘭試管苗容易生根，試驗(yàn)中生根率水平普遍高于50%。試驗(yàn)中選取了生根率、平均生根數(shù)和平均根長作為研究指標(biāo)，以便更全面地了解3種試驗(yàn)因素對(duì)非洲紫羅蘭試管苗生根的影響。生根率方面，使用IBA 0.2 mg/L的3個(gè)處理中有兩個(gè)處理達(dá)到了全部生根，說明同濃度下，IBA最易誘發(fā)非洲紫羅蘭試管苗生根。

碳源的種類和用量不僅影響試管苗的生根效率，而且對(duì)其地上部形態(tài)建成有十分重要的作用，是影響非洲紫羅蘭培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一[11]。有資料表明，碳源濃度最佳值通常在2%～5%，生根的時(shí)候碳源濃度適當(dāng)降低有利于試管苗根系的生長[12]。試驗(yàn)中平均生根數(shù)達(dá)到最優(yōu)水平為蔗糖20 g/L+檸檬酸100 mg/L+NAA 0.2 mg/L，且選取生長激素為NAA 0.2 mg/L的處理平均根長水平也是最優(yōu)，蔗糖20 g/L作為碳源的處理中平均生根數(shù)總和最多。褐化情況方面，選用檸檬酸100 mg/L，PVP 100 mg/L作為抗褐化劑的處理中均無褐化現(xiàn)象產(chǎn)生，而且極差分析結(jié)果表明，使用檸檬酸的抗褐化效果稍優(yōu)于PVP。

綜上，非洲紫羅蘭試管苗生根最優(yōu)處理為1/2 MS+蔗糖20 g/L+檸檬酸100 mg/L+NAA 0.2 mg/L。