魯麗蘋果植株再生體系的建立

張 健， 王 璐， 袁嘉瑋， 田時敏， 張戰(zhàn)備， 梁哲軍(1.山西農(nóng)業(yè)大學棉花研究所， 山西 運城 044000；2.果樹種質(zhì)資源創(chuàng)制與應用運城市重點實驗室， 山西 運城 044000)

我國對蘋果高效離體再生的研究始于20世紀90年代，近年來得到快速發(fā)展，目前已建立嘎啦、喬納金、宮藤富士、魯加6號等品種以及珠美海棠、M 26、BP-176、M 9 T 337等砧木的再生體系[1-3]。在上述體系研究中，基因型、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及配比、培養(yǎng)基種類、碳源種類和培養(yǎng)條件都是誘導蘋果植株再生過程中的主要影響因素。植物生長調(diào)節(jié)劑常以細胞分裂素和生長素配合使用，其中6-BA、IBA和TDZ以其較高的活性和穩(wěn)定性在組培工作中受到了廣泛的使用。在周愛琴等[4]研究中，柱形蘋果品種魯加5號體細胞胚的誘導使用6-BA 1.0 mg/L+NAA 5.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L效果最佳。高兵等[5]在嘎啦葉片離體誘導再生的相關研究中，使用2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 2.0 mg/L效果最佳。在碳源的選擇上，孫清榮等[6]發(fā)現(xiàn)不同基因型砧木品種適宜的碳源存在差異，54-118的最適碳源為蔗糖，而BP-174和M 9 T 337的最適碳源為山梨醇；在葉片處理方式上，葉片經(jīng)橫切、縱切、切塊等不同方式處理后，誘導再生的效果無明顯差異。而在誘導培養(yǎng)的初期通過暗處理的方式可產(chǎn)生大量分化潛力較大的愈傷組織，處理時間通常以14～21 d為宜[7-8]。蘋果的基因型決定了其離體葉片再生能力的強弱，是限制蘋果葉片高效再生體系的關鍵因素，再生頻率達到85%以上的品種較少，從而造成轉(zhuǎn)化效率極低的結果，限制了該技術的應用。再生能力與基因型之間的關系尚不明確，仍需不同品種再生體系的建立予以佐證。

魯麗蘋果作為中早熟蘋果新品種，具有優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、廣適、抗逆等突出特點，是當前中早熟蘋果更新的首選品種之一。但目前尚無其組培及葉片再生體系的相關研究，制約了該品種的快速發(fā)展。在本試驗前期研究中，以Bai-Quan Li等[9]研究報道的嘎啦葉片再生體系對魯麗葉片進行再生培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其并非完全適用于魯麗。因此本試驗以魯麗嫩莖為材料建立無菌苗體系，進一步以無菌苗葉片為試材，建立魯麗蘋果離體葉片再生體系，以期為該品種的組培快繁和遺傳改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以山西農(nóng)業(yè)大學棉花研究所楊包試驗基地果樹資源圃中栽植的魯麗蘋果為試材。試驗基地位于山西省運城市鹽湖區(qū)，試驗地年均氣溫11.9 ℃，年降雨量約500 mm，無霜期約190 d。供試品種為5年生魯麗，南北行向定植，株行距為4 m×1.5 m，樹體整形方式為主干型。常規(guī)管理，灌溉方式為微噴灌。

1.2 方 法

1.2.1試管苗的建立

5月上旬，剪取大田一年生幼嫩枝條，去除葉片后首先將嫩莖依次進行自來水沖洗30 min、洗潔精清洗10 min、自來水漂洗。清洗干凈的莖段用75%的酒精處理30 s，再于0.1%的HgCl2溶液中分別處理3 min、5 min、8 min和10 min，處理后用無菌水沖洗5遍接于MS培養(yǎng)基，每個處理5瓶，每瓶5株。15 d后統(tǒng)計污染率，30 d后統(tǒng)計成活率。培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，光照強度2 000 lx，光照時間16 h/d，下同。

1.2.2試管苗的增殖

莖段在啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d，誘導產(chǎn)生無菌芽苗，將其轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中。繼代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基(附加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂)，IBA濃度采用0.1 mg/L，6-BA濃度分別為0(ck)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L，pH值5.8。每個處理接種5瓶，每瓶5株，繼代3次統(tǒng)計增殖系數(shù)和玻璃化率。

1.2.3離體葉片不定梢誘導

剪取繼代30 d的健壯試管苗頂端第2、3片展開葉，用手術刀在垂直于葉脈的方向?qū)⑷~片割傷，轉(zhuǎn)接在葉片不定芽誘導培養(yǎng)基上。暗培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)16 h/d，45 d后統(tǒng)計再生頻率和再生葉片平均再生芽數(shù)。不定芽再生培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，碳源為30 g/L的蔗糖、葡萄糖和D-山梨醇，植物生長調(diào)節(jié)劑為IBA(0.3、0.5 mg/L)、6-BA(2、4、6 mg/L)和TDZ(2、4、6 mg/L)構成24個處理，每個處理5瓶，每瓶10片葉。

1.2.4試管苗生根誘導

選擇在繼代培養(yǎng)中株高2 cm左右的試管苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入不含植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計生根率和生根條數(shù)。生根培養(yǎng)基以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，碳源為20 g/L的蔗糖、瓊脂7 g/L，pH值5.8，植物生長調(diào)節(jié)劑為IBA(0.4、0.6、1.0 mg/L)、IAA 0.1 mg/L構成7個處理，每個處理3瓶，每瓶5株。

1.3 統(tǒng)計分析

本實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行處理，并采用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

表1 HgCl2消毒時間對魯麗外植體消毒效果的影響Table 1 Effect of disinfection time of HgCl2 on the Luli explants stertlizing

2 結果與分析

2.1 試管苗的建立

使用0.1% HgCl2溶液對魯麗外植體進行處理，處理3 min的污染率最高，為52%，處理10 min的污染率最低，為0。HgCl2處理時間過短無法完全殺死外植體表面細菌，處理過長會增加對外植體的毒害作用致其死亡。因而選擇成活率最高的處理為最佳處理方式，即75%酒精處理30 s后0.1% HgCl2處理5 min。

2.2 細胞分裂素6-BA濃度對魯麗試管苗增殖的影響

6-BA濃度在0～1.0 mg/L的范圍內(nèi)，試管苗增殖系數(shù)隨6-BA濃度的升高而增加，處理間差異顯著。0.8 mg/L和1.0 mg/L兩個處理的增殖系數(shù)均大于7且顯著高于其他處理。當6-BA濃度達到1.0 mg/L時，試管苗玻璃化率達到最高，為20.2%，此時部分叢生芽表現(xiàn)出質(zhì)地較脆、葉片肥大的玻璃化特征。而6-BA濃度為0.8 mg/L時，叢生芽長勢較好，苗色翠綠，苗高適宜。因此適合于魯麗試管苗增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為IBA 0.1 mg/L，6-BA 0.8 mg/L。

表2 6-BA和IBA濃度對魯麗增殖的影響Table 2 Effect of different concentrations of 6-BA and IBA on the multiplication of Luli

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對葉片再生的影響Table 3 Effects of different combinations of plant growth regulators on leaf regeneration

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑組合對魯麗葉片再生的影響

在誘導魯麗蘋果試管苗葉片再生的過程中，首先表現(xiàn)為葉片不同程度增大增厚，于葉柄和葉刻部位膨大形成愈傷組織，再形成綠色顆粒狀凸起，這些顆粒狀凸起最終分化成為不定芽。以TDZ為細胞分裂素的處理其葉片再生頻率和平均再生芽數(shù)均高于6-BA。

在以6-BA為細胞分裂素的處理中，IBA濃度為0.3 mg/L時，葉片再生頻率和平均再生芽數(shù)呈現(xiàn)隨6-BA濃度升高而降低的趨勢，6-BA濃度達到6 mg/L時再生率和再生芽數(shù)顯著低于其他處理，均降為0。而當IBA濃度為0.5 mg/L時，葉片再生頻率和平均再生芽數(shù)有隨6-BA濃度升高而升高的趨勢，6-BA濃度達到6 mg/L時再生率為20%、平均再生芽數(shù)為1.67，顯著高于其他處理。IBA濃度為0.3 mg/L時葉片增大程度較0.5 mg/L時小，且產(chǎn)生不定芽長勢略弱于后者。說明IBA在葉片增大和不定芽生長中發(fā)揮作用較為明顯，在誘導效率中需同6-BA協(xié)同發(fā)揮作用。

在使用TDZ為細胞分類素的處理中，當IBA濃度為0.3 mg/L時，葉片再生頻率和平均再生芽數(shù)均隨TDZ濃度升高而增加，其濃度達到6 mg/L時再生率達到96.7%、平均再生芽數(shù)達到4.33，顯著高于其他處理。而當IBA濃度為0.5 mg/L時，各處理間葉片再生頻率無明顯差異，但IBA濃度高的處理其誘導產(chǎn)生不定芽的長勢較低濃度處理健壯。細胞分裂素使用TDZ的處理，其葉片不定芽再生的時間早于使用6-BA的處理，又以處理7和處理11再生最早，這可能與IBA與TDZ濃度比有關。同時TDZ處理的葉片再生頻率顯著和再生葉片平均再生芽數(shù)均顯著高于6-BA的處理。這表明TDZ比6-BA更有利于魯麗蘋果離體葉片的再生。綜上分析，最適宜魯麗蘋果葉片離體再生的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為TDZ 6 mg/L，IBA 0.3 mg/L。

2.4 不同碳源對魯麗葉片再生的影響

在IBA和6-BA濃度一定的情況下，以葡萄糖作為碳源的處理其葉片再生頻率最高達到40%，再生葉片平均再生芽數(shù)達到1.91，均略高于以山梨醇和蔗糖作為碳源的處理，但差異未達顯著水平。

2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對試管苗生根的影響

不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對魯麗試管苗生根率和平均根條數(shù)的影響不同。當生根培養(yǎng)基中僅添加IAA時，試管苗生根率最低，為13.3%，平均根條數(shù)最少，僅0.7。當培養(yǎng)基中同時添加IAA和IBA時，生根率和平均根條數(shù)顯著高于僅添加一種生長素的處理，其形態(tài)為白色粗壯的根系，試管苗基部無膨大、僅有極少量的愈傷組織，同時其誘導根系出現(xiàn)的時間早于其他處理，其中，處理4的生根率達到100%，平均根條數(shù)為12.8。綜上分析，魯麗試管苗的最佳生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L。

表4 不同碳源對葉片再生的影響Table 4 Effects of different carbon sources on leaf regeneration

3 討 論

在已建立的相關體系研究中，常用的消毒試劑為75%的酒精和0.1% HgCl2溶液。但不同基因型外植體對消毒試劑的不同耐受程度，會導致消毒時間存在差異。如煙富6號、玉華早富、中秋王，砧木SH 6和M 9 T 337等消毒以新芽為外植體，0.1% HgCl2溶液的處理時間多為7～10 min[10-12]；馬冬菁[13]以紅肉蘋果莖尖和莖段作為外植體，與本試驗結果相同，魯麗品系外植體經(jīng)0.1% HgCl2溶液處理的最佳時間同樣為5 min。同品種間由于基因型不同，在消毒程序與培養(yǎng)過程中植物生長調(diào)節(jié)劑使用配比存在差異，植物生長調(diào)節(jié)劑在誘導組培苗生根的過程中作用效果顯著，使用IBA、IAA植物激素處理嘎啦系品種可顯著提高生根率[15]。因此在本試驗條件下，將IBA和IAA配合使用，其濃度分別為1 mg/L和0.1 mg/L時生根率達100%，平均根條數(shù)為12.8，且根系粗壯潔白，其誘導結果優(yōu)于單獨使用，這說明兩種植物生長調(diào)節(jié)劑在誘導生根的過程中發(fā)揮協(xié)同作用。但其所生根系與莖之間仍有少量愈傷的存在，可能造成根部的維管束與莖內(nèi)維管束無法連通，影響營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，導致移栽成活率的下降。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對試管苗生根的影響Table 5 Effects of different combinations of plant growth regulators on rooting of test-tube seedlings

圖1 魯麗蘋果試管苗增殖與生根Fig.1 Proliferation and rooting of in vitro shoots of Luli apple

本研究在利用形態(tài)學響應分析魯麗蘋果葉片離體再生的發(fā)生途徑中發(fā)現(xiàn)，魯麗離體再生過程中細胞分裂和分化的生理過程受細胞分裂素和生長素調(diào)控。本試驗中T 7和T 11的不定芽在誘導20 d以內(nèi)出現(xiàn)，早于其他處理，且TDZ為細胞分裂素的處理再生效率遠高于使用6-BA的處理。說明TDZ與IBA共同作用于離體的葉片再生的誘導過程且誘導活力與其濃度比有關。在早期的研究中認為TDZ具備類細胞分裂素的活性[16]，也有研究表明TDZ通過調(diào)節(jié)植物內(nèi)源細胞分裂素和生長素的合成從而影響相應生理過程[17-18]。TDZ發(fā)揮細胞分裂素活性的同時也促進了植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑的合成與積累，導致其在離體葉片誘導過程中表現(xiàn)出高效再生的效果。但經(jīng)TDZ誘導后植株不定芽細小而密集，伸長生長不足，在繼代培養(yǎng)過程中需要將其轉(zhuǎn)接至6-BA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以促其伸長生長。

已有研究中，珠美海棠葉片再生最適宜的碳源為果糖[19]，砧木BP-176和54-118最適宜的碳源是山梨醇[6,20]，而大部分的果樹芽再生誘導中最適宜的碳源是蔗糖，這可能與基因型差異試材對不同碳源物質(zhì)響應不同有關，葡萄糖、蔗糖、果糖等碳源均是具備信號分子功能的細胞代謝因子，受基因調(diào)控影響植株生長發(fā)育[21]。在培養(yǎng)基的制備過程中，碳源經(jīng)高溫滅菌之后形成了不同的滲透壓和pH，從而影響了葉片再生過程中營養(yǎng)元素的吸收和植物生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)控。在本研究中最適宜的碳源是葡萄糖，表明魯麗葉片更適應葡萄糖滅菌后形成的培養(yǎng)環(huán)境，從而影響了其再生的效率。再生途徑一般分為器官再生途徑和體細胞胚途徑。本研究通過分析誘導過程的形態(tài)學響應發(fā)現(xiàn)葉片再生誘導的過程中，先產(chǎn)生愈傷組織，誘導的非胚性愈傷呈現(xiàn)白色和疏松膨大的狀態(tài)，而胚性愈傷呈現(xiàn)黃綠色或綠色的狀態(tài)，這與陳春玲等[22-23]的研究結果一致。但其再生途徑為芽再生途徑還是體細胞胚再生途徑，還需在組織細胞學水平進一步研究確定。

4 結 論

以魯麗蘋果嫩莖為外植體適宜的消毒方式為75%酒精處理30 s，0.1% HgCl2溶液處理5 min；試管苗增殖的最適培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+瓊脂7 g/L；葉片離體再生的最適培養(yǎng)基為：MS+IBA 0.3 mg/L+TDZ 6.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，再生率達到96.5%，再生葉片平均再生芽數(shù)為4.33；1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂7 g/L適用于生根培養(yǎng)，生根率為100%。本研究建立的魯麗蘋果組培快繁和葉片再生體系，為其組培快繁和遺傳改良提供了技術參考，為離體葉片誘導芽再生的機理研究提供了先決條件。本體系的建立可加快促進北方蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，進一步助力注重產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢和經(jīng)濟效益的果業(yè)結構性改革。

圖2 魯麗蘋果葉片離體再生Fig.2 Adventitious shoot regeneration from leaf explants of Luli apple