鹽脅迫對桔梗種子萌發(fā)和幼苗光合特性的影響

信龍飛， 谷彩花， 張艷玲， 劉紅云， 管志昊， 張 莉(信陽農(nóng)林學院農(nóng)學院， 河南 信陽 464000)

土壤鹽堿化嚴重影響生態(tài)環(huán)境，是阻擋土壤可持續(xù)利用的主要問題之一。我國鹽漬化土壤面積約為9 913萬hm2，主要集中在我國的東北，華北和西北內陸地區(qū)以及長江以北的沿海區(qū)域[1]。土壤鹽堿化造成土地肥力下降甚至喪失，隨著化肥和農(nóng)藥的廣泛使用，農(nóng)田不合理灌溉，栽培管理措施不當?shù)?，土壤鹽堿化的問題也日益嚴重，已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[2]。研究表明，植物種子萌發(fā)階段是植物生長的關鍵時期[3]，種子出苗的質量決定植株后期的生長狀況，鹽脅迫是影響種子發(fā)芽時間、發(fā)芽率、出苗率的主要因素之一。幼苗期是植物對外界逆境脅迫非常敏感的時期，過量的鹽會引起光系統(tǒng)結構和功能的改變，光合作用往往也受到抑制，從而導致其生產(chǎn)力下降，但不同植物對鹽脅迫耐受性表現(xiàn)不同[4-5]。光合作用是植物最基本且非常重要的生理代謝之一，光系統(tǒng)是進行光吸收的功能單位，光合作用的強弱和光系統(tǒng)的穩(wěn)定性對植物生長、產(chǎn)量及其抗逆性都具有十分重要的影響，生產(chǎn)上常將其作為植物生長和抗逆性的指標[6]。因此，研究鹽脅迫對植物種子萌發(fā)及幼苗光合特性的影響，對耐鹽植物的選擇和應用具有重要的生產(chǎn)指導意義。

桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.)為桔?？平酃俣嗄晟荼局参铮且环N藥食同源型植物，具有很高的經(jīng)濟價值，其根可入藥，具有消炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂、鎮(zhèn)靜、解熱等功效，也可作觀賞花卉。桔梗是常用大宗藥材，市場需求量逐漸增加，人工栽培面積也日益增大。目前關于桔梗的研究多集中在種子萌發(fā)[7-8]、抗逆性[9-10]、化學成分[11]等方面，盡管前人對鹽脅迫條件下桔梗種子萌發(fā)和生理特性進行了相關研究[12-13]，但是很少從光合系統(tǒng)入手探究鹽脅迫下桔梗的光合調節(jié)機制。因此，本研究以桔梗為試驗材料，設置不同濃度NaCl處理，研究桔梗在不同濃度鹽脅迫下的種子萌發(fā)特性和幼苗光合特性變化，為桔梗在鹽堿化土壤上推廣栽培和耐鹽機制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桔梗種子采自信陽農(nóng)林學院的藥用植物園，經(jīng)自然干燥后避光保存。

1.2 試驗設計

1.2.1鹽脅迫對桔梗種子萌發(fā)的影響

采用培養(yǎng)皿發(fā)芽法，在培養(yǎng)皿內放置雙層濾紙，隨機挑選大小一致、飽滿的桔梗種子，用75%乙醇溶液消毒5 min，蒸餾水清洗干凈。每個培養(yǎng)皿中均勻擺放50粒桔梗種子，將濃度為0、25、50、100、200、300、400 mmol/L的NaCl溶液依次加入培養(yǎng)皿內，每個處理3個重復，將培養(yǎng)皿置于人工氣候室。每天統(tǒng)計桔梗種子的發(fā)芽情況，當種子露出胚根或胚芽時，開始記錄種子胚根和胚芽的長度，連續(xù)觀察記錄至第15天。

1.2.2鹽脅迫對桔梗幼苗生長和光合特性的影響

采用盆栽的方法，將桔梗種子均勻播種于花盆內。將花盆置于人工氣候室，光照強度200 μmol/(m2·s)，光照/黑暗時間為14 h/10 h，晝夜溫度為28 ℃和20 ℃，相對濕度為70%。待幼苗長至4片葉時，將0、25、50、100、200、300、400 mmol/L的NaCl溶液分別倒入花盆內，每處理10株，3次重復。處理15 d時，取樣測定相關指標。

1.3 測定項目與方法

1.3.1發(fā)芽指標、胚芽、胚根的測定

根據(jù)統(tǒng)計的發(fā)芽數(shù)計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率[14]，計算公式如下：

發(fā)芽勢(%)=(第10天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(第14天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

相對發(fā)芽勢(%)=(處理發(fā)芽勢/對照發(fā)芽勢)×100%；

相對發(fā)芽率(%)=(處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率)×100%；

用電子游標卡尺測定種子的胚芽長和胚根長。

1.3.2生物量和含水量的測定

取長勢一致的桔梗幼苗，將幼苗分地上部分和地下部分，分別測定其鮮重，再置于105 ℃烘箱中殺青15 min，60 ℃烘干至恒重，分別測定干重，計算植株的含水量。

1.3.3葉綠素含量和光合參數(shù)的測定

葉綠素含量的測定參照侯福林[15]的方法；光合參數(shù)的測定在09：00—11：00時進行，使用便攜式光合儀TARGAS-1測定植株凈光合速率(Pn)、葉片氣孔導度(Gn)、細胞間隙CO2濃度(Ci)等，計算氣孔限制值(Ls)，Ls=(Ca-Ci)/Ca，其中Ca為大氣CO2濃度。

1.3.4葉綠素熒光參數(shù)的測定

使用植物效率分析儀Handy PEA測定桔梗幼苗葉綠素熒光參數(shù)[16]。測定前將葉片置于葉夾中，暗適應30 min，用弱測量光測得葉片的初始熒光(Fo)，隨后打開飽和脈沖測得葉片的最大熒光(Fm)，計算Fv/Fm和Fv/Fo。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 22.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對桔梗種子萌發(fā)的影響

表1顯示，隨NaCl濃度的升高，桔梗種子的發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率和相對發(fā)芽率均呈下降的趨勢。NaCl濃度為25、50 mmol/L時，發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率和相對發(fā)芽率較對照稍有下降，但無顯著差異(p>0.05)。在NaCl濃度為200、300、400 mmol/L處理下，發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽率和相對發(fā)芽率較對照顯著降低(p<0.05)，其發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別比對照下降了66.67%、86.67%、97.78%和47.52%、71.29%、92.57%。說明低濃度鹽脅迫對桔梗種子萌發(fā)抑制作用不明顯，隨著鹽脅迫濃度的升高，其對桔梗種子萌發(fā)產(chǎn)生的鹽害作用增大，抑制作用增強。

表1 鹽脅迫下桔梗種子的發(fā)芽指標Table 1 Seed germination indexes of P. grandiflorum under salt stress

2.2 鹽脅迫對桔梗種子胚芽長和胚根長的影響

由圖1可看出，桔梗種子胚芽伸出的起始時間隨著NaCl濃度的增加而延遲。正常條件下，桔梗種子第6天時胚芽開始伸出，當NaCl濃度為25、50、100 mmol/L時，胚芽伸出的起始時間為第7～9天，尤其是NaCl濃度增加至200、300、400 mmol/L時，胚芽伸出的起始時間為第12天。第15天時，對照的桔梗種子胚芽長為3.83 mm。與對照相比，鹽脅迫處理的胚芽增長速度呈下降的趨勢。在第6～10天，NaCl濃度為25、50 mmol/L處理的胚芽長明顯低于對照，而第10天之后，其胚芽長逐漸接近對照，第15天時的胚芽長分別為3.92 mm和3.90 mm；而NaCl濃度為300、400 mmol/L處理的胚芽的增長較為緩慢，在第15天時，其胚芽長只有1.53 mm和0.12 mm，分別比對照減少了60.14%和96.98%。由此可見，低濃度的鹽脅迫對桔梗種子萌發(fā)后期胚芽的生長影響較小，而高濃度的鹽脅迫會明顯延遲胚芽伸出的起始時間，并嚴重抑制胚芽的生長。

圖1 鹽脅迫對桔梗胚芽長的影響Fig.1 Effects of salt stress on plumule length of P. grandiflorum

由圖2可知，正常條件下，桔梗種子第5天時開始長出胚根，25、50 mmol/L NaCl處理的胚根伸出時間與對照相同，100、200、300、400 mmol/L NaCl處理導致胚根伸出時間推遲，分別為第6、6、8、11天。隨著萌發(fā)時間的延長，NaCl濃度為25、50 mmol/L處理的胚根長與對照差距較小，第15天時，其胚根長稍高于對照，分別為11.32 mm和11.41 mm；NaCl濃度為100、200 mmol/L時，第15天時的胚根長分別較對照減少7.64%和36.06%；NaCl濃度為300、400 mmol/L處理的胚根增長緩慢，第15天時，胚根長只有2.45 mm和0.52 mm，明顯低于對照。這說明低濃度鹽脅迫對桔梗種子胚根生長抑制作用較小，而當濃度升高時，鹽脅迫對胚根的生長將產(chǎn)生明顯的抑制作用，鹽濃度越高，抑制作用越強。

圖2 鹽脅迫對桔梗胚根長的影響Fig.2 Effects of salt stress on radicle length of P. grandiflorum

2.3 鹽脅迫對桔梗幼苗植株含水量的影響

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，正常條件下，桔梗幼苗植株含水量最大，為78.49%。隨著鹽濃度的增加，植株含水量呈逐漸下降的趨勢。與對照相比，25、50 mmol/L NaCl處理的植株含水量下降幅度較小，差異不顯著(p>0.05)；NaCl濃度為100、200、300、400 mmol/L時，植株含水量分別下降了3.52%、4.62%、6.93%、8.82%，均與對照存在顯著差異(p<0.05)。這表明，在較低濃度鹽脅迫下，桔梗幼苗植株體內的水分能保持相對平衡的狀態(tài)，而高濃度的鹽脅迫會造成植株根系吸收困難，打破植株吸水和失水的動態(tài)平衡，從而導致植株含水量降低。

2.4 鹽脅迫對桔梗幼苗生物量的影響

表2顯示，與對照相比，NaCl處理后，桔梗幼苗生物量減少，不同濃度的NaCl處理，其生物量減少幅度不同。25、50 mmol/L NaCl處理對桔梗幼苗地上部干重、根干重、整株干重的變化影響較小，與對照差異不顯著(p>0.05)。隨著鹽脅迫濃度的增高，桔梗幼苗生物量呈明顯的下降趨勢。尤其是當NaCl濃度增至300、400 mmol/L時，桔梗幼苗地上部干重、根干重、整株干重急劇下降，分別較對照減少了33.71%、55.01%、48.08%和43.82%、66.94%、59.41%，且均與對照存在顯著差異(p<0.05)。這說明高濃度的鹽脅迫會顯著抑制桔梗幼苗地上部和根系生物量的積累，導致植株生物量下降。

注：圖中不同字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。圖3 鹽脅迫對桔梗幼苗植株含水量的影響Fig.3 Effects of salt stress on water content of P. grandiflorum seedlings

表2 鹽脅迫對桔梗幼苗生物量的影響Table 2 Effects of salt stress on the biomass of P. grandiflorum seedlings

2.5 鹽脅迫對桔梗幼苗葉綠素含量的影響

由表3可知，隨著NaCl濃度的升高，桔梗幼苗葉片葉綠素含量先升高后降低。NaCl濃度為25 mmol/L處理的葉綠素含量最高，其他濃度鹽脅迫處理的葉綠素含量均不同程度地低于對照。當NaCl濃度為100、200、300、400 mmol/L時，其葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、總葉綠素含量明顯下降，總葉綠素含量分別比對照降低了33.33%、35.38%、48.09%、69.18%，與對照均存在顯著差異(p<0.05)，同樣桔梗幼苗葉綠素a/b隨著NaCl濃度的增加先升高后降低，當NaCl濃度為50 mmol/L時，葉綠素a/b最高，與對照差異不顯著(p>0.05)。當NaCl濃度為200、300、400 mmol/L時，葉綠素a/b分別較對照降低11.18%、30.96%、36.48%，與對照均存在顯著差異(p<0.05)。表明，低濃度鹽脅迫可引起桔梗幼苗葉綠素含量的升高，高濃度鹽脅迫則會導致桔梗幼苗葉綠素降解，葉綠素含量降低，進而影響植株光合效率。

表3 鹽脅迫對桔梗幼苗葉綠素含量的影響Table 3 Effects of salt stress on chlorophyll content of P. grandiflorum seedlings

2.6 鹽脅迫對桔梗幼苗光合作用的影響

由圖4可知，鹽脅迫不同程度地影響桔梗幼苗葉片光合作用的強弱。隨著鹽濃度的升高，桔梗葉片Pn呈逐漸下降的趨勢。與對照相比，NaCl濃度為25、50 mmol/L處理的Pn下降，但差異不顯著(p>0.05)；其他處理的Pn較對照分別降低36.60%、74.74%、86.94%、95.30%，達到顯著差異(p<0.05)。鹽脅迫下桔梗葉片Gs呈先升高后下降的趨勢，NaCl濃度為25 mmol/L處理的Gs最大，比對照高9.26%，但差異不顯著(p>0.05)，其他處理的Gs均顯著低于對照(p<0.05)。

圖4 鹽脅迫對桔梗幼苗光合作用的影響Fig.4 Effects of salt stress on photosynthesis of P. grandiflorum seedlings

桔梗葉片Ci隨著鹽脅迫濃度的增加先下降后升高。與對照相比，NaCl濃度為25、50 mmol/L處理的Ci下降，NaCl濃度為100 mmol/L處理的Ci升高，這三組處理均與對照不存在顯著差異(p>0.05)；NaCl濃度為200、300、400 mmol/L時，Ci較對照顯著升高(p<0.05)。與Ci的變化相反，Ls隨著鹽脅迫濃度的增加先升高后降低。NaCl濃度為25、50 mmol/L時，Ls增大，比對照增加1.24%、4.61%，不存在顯著差異(p>0.05)；隨著NaCl濃度的升高，Ls較對照顯著降低(p<0.05)，尤其是NaCl濃度為300、400 mmol/L時，Ls為0.34和0.25。試驗結果顯示，低濃度鹽脅迫下桔梗葉片光合參數(shù)變化較小，高濃度鹽脅迫會導致Gs和Ls減小，Ci升高，光合速率下降。

2.7 鹽脅迫對桔梗幼苗葉綠素熒光的影響

Fv/Fm是PSⅡ反應中心最大光化學量子產(chǎn)量，反映光反應中心PSⅡ的潛在活性與原初光能轉化效率，F(xiàn)v/Fo表示PSⅡ反應中心潛在光化學效率。由圖5可以看出，隨著鹽脅迫濃度的升高，桔梗葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo均呈下降趨勢。當NaCl濃度為25、50 mmol/L時，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo下降緩慢。當NaCl濃度增加至為100、200、300、400 mmol/L時，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo出現(xiàn)較為迅速的下降，F(xiàn)v/Fm分別比對照降低了1.88%、3.67%、4.34%、6.94%，F(xiàn)v/Fo分別比對照降低了9.54%、17.31%、19.94%、29.05%，均與對照差異顯著(p<0.05)。結果表明，高濃度的鹽脅迫減弱了桔梗幼苗葉片PSⅡ原初光能轉化效率和潛在光化學效率，導致桔梗幼苗PSⅡ活性中心受到損害，破壞植株葉片光合器官的生理狀態(tài)。

圖5 鹽脅迫對桔梗幼苗葉綠素熒光的影響Fig.5 Effects of salt stress on chlorophyll fluorescence of P. grandiflorum seedlings

3 討論與結論

發(fā)芽率和發(fā)芽勢是衡量種子生活力和發(fā)芽能力的重要指標。本試驗中，25、50 mmol/L鹽脅迫下桔梗種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率與對照差異不顯著，萌發(fā)早期其胚芽長和胚根長略低于對照，但隨著時間的延長，其長度逐漸接近甚至高于對照，這表明低濃度鹽脅迫對桔梗種子發(fā)芽能力影響不顯著。當NaCl濃度高于100 mmol/L時，桔梗種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著下降，隨著鹽脅迫濃度的升高，發(fā)芽勢和發(fā)芽率均呈逐漸降低趨勢，種子開始發(fā)芽的時間明顯延遲，胚芽和胚根增長速度減慢。說明高濃度鹽脅迫抑制桔梗種子的發(fā)芽能力、阻礙胚芽和胚根的生長、推遲發(fā)芽時間，該結果與高昆，韋加幸[17]在錦燈籠和師東，張愛勤[18]對補血草的研究結果一致。何學青等[19]研究認為，高濃度鹽脅迫抑制種子萌發(fā)原因有兩個，一是滲透作用，即外部環(huán)境為低滲溶液時，種子吸水膨脹，種子外部環(huán)境為高濃度鹽溶液時，則種子吸水困難；二是離子毒害，高濃度的鹽離子會隨著滲透作用進入種子，產(chǎn)生毒害作用，破壞種子內部結構，影響種子萌發(fā)。

鹽脅迫對植物生長發(fā)育和生理生化的影響表現(xiàn)在很多方面，尤其對光合作用的影響最為顯著[20]。葉綠素是光合作用的光能捕獲物質基礎，其含量高低在一定程度上能反映植物光合作用的強弱[21]。鹽脅迫下植株葉片的葉綠素含量降低，可能是由于鹽脅迫后，葉綠體色素合成酶活性降低，葉綠素酶活性增強，葉綠素合成受阻而分解加快，導致葉綠素含量下降[22]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下，植物葉片的葉綠體結構易遭受破壞，引起了葉綠體功能的紊亂，影響葉綠素的穩(wěn)定和光合作用的正常進行[23]。本實驗結果表明，25 mmol/L鹽脅迫能使桔梗葉片葉綠素含量升高，隨著鹽濃度的繼續(xù)增加，葉綠素含量顯著降低，這與前人的研究結果一致[24-25]。輕微鹽脅迫引起葉綠素含量增加，可能與植株的含水量下降有關。試驗還發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高，桔梗葉片葉綠素a/b顯著下降，表明葉綠素a的降解速度要快于葉綠素b，這將直接阻礙葉綠素對光能的轉換吸收和光化學反應。

Ca等[26]研究表明，植物葉片光合速率下降的主要原因是氣孔限制和非氣孔限制。氣孔是植物葉片與外界氣體交換和向外界散失水分的主要通道，是影響植物光合作用的重要因素之一。光合速率下降是否與氣孔限制有關，要根據(jù)Gs和Ci的變化綜合判斷。本試驗中，隨著鹽濃度的升高，桔梗幼苗葉片Pn逐漸下降，生物量的積累不斷減少。鹽脅迫濃度為25、50 mmol/L處理時，桔梗葉片Gs和Ci同時下降。說明輕度鹽脅迫下桔梗Pn的降低主要是受氣孔限制的影響，這可能是由于鹽脅迫引起了滲透脅迫，使氣孔關閉，阻礙環(huán)境CO2進入葉肉細胞，最終導致光合進程受阻，光合速率下降。而鹽脅迫濃度高于100 mmol/L時，桔梗葉片Pn、Gs、Ls迅速下降，而Ci并沒有下降，反而明顯高于對照，說明高濃度鹽脅迫下桔梗Pn的降低主要是受非氣孔限制的影響，這可能是由于高鹽脅迫下細胞中積累了過量鹽離子，破壞了葉綠體結構，最終導致葉肉細胞同化CO2的能力減弱，使Ci濃度升高，該結果與水稻上的研究相似[27]。

逆境脅迫會對植物的葉綠體光合機構造成損傷，降低PSⅡ反應中心原初光能轉換效率和潛在光化學效率，從而導致植物光合特性的改變[20]。葉綠素熒光參數(shù)可以直接反映逆境脅迫對植物光能吸收、轉化和電子傳遞的影響[28]。研究結果表明，當鹽濃度為25、50 mmol/L時，桔梗幼苗Fv/Fm和Fv/Fo維持在較高的水平，說明低濃度鹽處理下桔梗葉片PSⅡ反應中心受到的影響較小，光能轉化效率未發(fā)生顯著改變，也進一步證實低濃度鹽脅迫下桔梗葉片光合速率的下降主要是由于氣孔因素引起的。但當濃度高于100 mmol/L時，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo開始顯著下降，說明桔梗幼苗光合機構PSⅡ反應中心受到傷害，光合電子的傳遞受到限制，光化學電子傳遞效率和光能轉換效率降低，導致過剩光能的積累并產(chǎn)生光抑制，進而限制光合作用的正常進行，這也是高濃度鹽脅迫造成桔梗光合速率下降的重要原因之一，這與烏鳳章[29]，孫文君等[30]的研究結果基本一致。

綜上所述，鹽脅迫下桔梗種子萌發(fā)和幼苗光合特性的綜合表現(xiàn)表明，在25、100 mmol/L鹽脅迫下桔梗種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、幼苗生物量、葉片葉綠素含量、光合特性沒有受到顯著影響，表明其對低濃度鹽脅迫具有一定的適應和耐受能力，此時氣孔限制是影響桔梗光合作用的主要因素；但當鹽濃度高于100 mmol/L時，桔梗種子萌發(fā)能力、幼苗生物量積累、葉綠素含量、光合速率、光化學效率均顯著降低，此時非氣孔限制和PSⅡ光化學活性下降是影響光合作用的主要因素。