湖泊型藻類培養(yǎng)與致嗅物質(zhì)產(chǎn)生的研究初探

于紅玲， 郭茜楠， 韓 旭

(天津水務集團水質(zhì)監(jiān)測中心， 天津 300241)

隨著水體富營養(yǎng)化情況的加劇，國內(nèi)外很多區(qū)域報道湖泊、水庫出現(xiàn)了藻類爆發(fā)的情況。目前世界各國對藻類相關代謝產(chǎn)物的研宄已經(jīng)相當廣泛和深入。藻類的次生代謝產(chǎn)物嗅味物質(zhì)直接影響飲用水的感官性狀，引起了越來越多人的關注。20世紀50年代末至今，已有二十多個國家先后報道了水體存在異味的問題并進行了相關研究。近年來，我國各地突發(fā)飲水污染事件頻發(fā)，據(jù)調(diào)查其中很多和飲用水中藻類產(chǎn)生的異味相關[1]。同時，全球氣候變暖和CO2濃度的增加也為藍藻生長提供了有利條件，導致水體中藍藻大量繁殖形成藍藻水華， 影響了水域生態(tài)系統(tǒng)、旅游業(yè)及生態(tài)景觀。更為嚴重的是，某些有害藍藻分泌的毒素或致嗅物質(zhì)會使飲用水水質(zhì)惡化， 對居民飲用水安全構成威脅[2]。這其中以2-甲基異莰醇及土臭素最為常見。兩者均為萜類化合物， 20 世紀 60 年代在放線菌中被發(fā)現(xiàn)[3]，其嗅閾值(OTC)較低，分別為15和10 ng/L。多種藻類也能產(chǎn)生這兩種嗅味物質(zhì)[4]。通常情況下，在藻類繁殖季節(jié)，我國部分湖泊、水庫等部分水體中的2-甲基異莰醇及土臭素濃度會超過10 ng/L，因此，進行藻類計數(shù)、土臭素和2-甲基異莰醇的檢測很重要[5]。

筆者結合近年來北方湖泊、水庫中較為常見的藻類，選擇了3種藍藻，初步摸索了藻類培養(yǎng)條件，在保證藻類能正常培養(yǎng)、傳代后，確定了藻類計數(shù)方法，搭建了致嗅物質(zhì)的固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀快速檢測方法，對藻類培養(yǎng)液開展檢測，以期為進一步研究藻類與致嗅物質(zhì)相關性、水中致嗅物質(zhì)的去除等問題打下基礎。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)藻類

實驗所選擇的3種藻類的信息[6]見表1。

表1 3種藻類的基本信息

1.2 儀器和試劑

人工氣候培養(yǎng)箱(bluepard)；生物顯微鏡(Olympus BX51)；氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀( GC-MS；Agilent 8890-5977A)，具備CTC自動進樣器固相微萃取模塊；氣相相色譜柱：DB-5MS型毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高壓滅菌鍋。

Milli-Q 超純水，15 MΩ·cm；BG11培養(yǎng)基；土臭素、2-甲基異莰醇混標，100 μg/mL；2-異丁基-3-氧基吡嗪，1 000 μg/mL；氯化鈉，500 g，優(yōu)級，經(jīng)450℃烘烤2 h后置干燥器內(nèi)備用；高純氦，純度≥99.999%；移液槍。

藻種購置于中國科學院淡水藻種庫。

1.3 人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件

根據(jù)初步摸索，確定藻類培養(yǎng)條件見表2。

1.4 藻類傳代與培養(yǎng)方式

1.4.1培養(yǎng)基配制

依據(jù)BG11培養(yǎng)基配制要求，進行培養(yǎng)基配制、分裝與高壓滅菌。

1.4.2藻種復蘇

取10 mL所購買藻種，加入10 mL BG11培養(yǎng)液，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日鏡下觀察培養(yǎng)液中藻類形態(tài)，待藻類狀態(tài)正常時進行擴增培養(yǎng)。

1.4.3藻種傳代

用移液槍取1 mL藻類原培養(yǎng)液，置于100 mL新配制的BG11培養(yǎng)液中，混勻，放置于人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 致嗅物質(zhì)檢測方法

1.5.1藻類培養(yǎng)液樣品的準備

將藻類培養(yǎng)液混勻，取1 000 mL容量瓶，少量純水打底，用移液槍取1 mL藻類原培養(yǎng)液至1000 mL容量瓶中，定容搖勻。取頂空瓶，用10.00 mL移液管從已定容的容量瓶中量取10.00 mL稀釋培養(yǎng)液至頂空瓶中，加入3 g氯化鈉，加入內(nèi)標物(2-異丁基-3-甲氧基吡嗪，濃度40 ng/L)，立即加蓋密封，搖勻，待測。

1.5.2檢測儀器參數(shù)

頂空固相微萃取進樣條件：加熱平衡溫度，60℃；加熱平衡時間，30 min。

氣相色譜儀參考條件：進樣口溫度，250℃；進樣方式，不分流進樣；升溫程序，起始溫度60℃保持2.5 min，以8℃/min速率升至250℃，保持5 min；離子源溫度，230℃；連接線溫度，280℃；離子化能量，70 Ev；掃描模式，選擇離子檢測(SIM)，選擇離子檢測參數(shù)見表 3。

1.6 藻類計數(shù)方法

參考《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術規(guī)程》(SL 733—2016 )中密度分析要求[7]，在光學顯微鏡下計數(shù)。

2 結果與討論

2.1 藻類培養(yǎng)條件的確定

結合目前湖泊、水庫中藍藻繁殖季節(jié)的溫度和藍藻的生活習性，確定了藻類培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為60%，光照為1 200 Lux。

每日對藻類培養(yǎng)液進行搖勻，以避免藻類過度聚集，影響生長。同時，應每日隨機改變藻類培養(yǎng)液在人工氣候培養(yǎng)中的位置，以保證藻類均勻接收到光照。

2.2 藻類傳代方式的確定

嘗試了兩種傳代方式，一種是對藻類培養(yǎng)液進行離心，分離出藻類，再對藻類進行復溶，隨后稀釋轉接進入培養(yǎng)基進行傳代。使用該方法傳代后，在顯微鏡下觀察藻類形態(tài)，發(fā)現(xiàn)藻類損傷嚴重，需要1周甚至更長的時間才能恢復到正常狀態(tài)。

另一種是選擇用移液槍取適量原藻類培養(yǎng)液，轉移進入新配培養(yǎng)基，進行稀釋的傳代方式。該方式下在藻類傳代后隔日鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其形態(tài)正常，在生長周期內(nèi)狀態(tài)較穩(wěn)定。

因此，最終選擇在1 ∶100(原培養(yǎng)液 ∶培養(yǎng)基)的條件下，用移液槍進行稀釋傳代，不再進行離心。傳代周期為25～32 d。

2.3 致嗅物質(zhì)檢測方法的性能考察

在確定了藻類培養(yǎng)方式后，使用固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀對藻類培養(yǎng)液中土臭素、2-甲基異莰醇進行檢測。

2.3.1方法的標準曲線

使用內(nèi)標法進行定量，繪制標準曲線，曲線范圍在0～100 ng/L。以目標物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標、定量離子峰面積為縱坐標，得到土臭素擬合曲線方程為：y=1.220 988x+0.008 057，R2=0.999 3；2-甲基異莰醇擬合曲線方程為：y=0.490 214x-0.003 701，R2=0.999 9。該方法濃度點設置均勻，線性良好。

2.3.2方法的檢出限

根據(jù)檢出限計算公式MDL=3.143S(n=7)，計算得到土臭素與2-甲基異莰醇的檢出限見表4。

表4 致嗅物質(zhì)的檢出限

2.3.3方法的精密度與準確度

向水體中分別加入10與20 ng/L標準物質(zhì)，進行回收率與精密度實驗，土臭素與2-甲基異莰醇的加標回收率在95%～107%之間，相對標準偏差小于5%。該檢測方法的回收率較高，精密度較好。

2.4 藻類計數(shù)方式的確定

使用陽性純藻種(偽魚腥藻)進行測定(n=12)，計數(shù)平均值為538×104cells/L，相對標準偏差為2.3%。該方法計數(shù)準確，精密度較好。

2.5 藻類產(chǎn)生致嗅物質(zhì)情況

對培養(yǎng)的偽魚腥藻、水華束絲藻和拉式擬浮絲藻，在傳代初期、中期、末期分別進行嗅味物質(zhì)檢測，其檢出結果見表5。

結果顯示，在3種藻類傳代后的初期、中期、末期，只有偽魚腥藻可以檢出2-甲基異莰醇，其余藻類均未檢出致嗅物質(zhì)，土臭素在3種藻類培養(yǎng)液中均未檢出。偽魚腥藻的藻類計數(shù)結果與2-甲基異莰醇的檢出數(shù)據(jù)為正相關。

表5 3種培養(yǎng)藻類產(chǎn)生致嗅物質(zhì)的情況

3 結論與展望

通過條件摸索，初步建立了偽魚腥藻、水華束絲藻、拉式擬浮絲藻的培養(yǎng)與傳代方式。結合培養(yǎng)情況，確定了藻類計數(shù)與土臭素、2-甲基異莰醇的檢測方法。初步搭建了藻類計數(shù)與致嗅物質(zhì)相關性研究平臺。未來，應進一步采用所確定的方法開展藻類培養(yǎng)的相關研究。同時聯(lián)系實際供水生產(chǎn)需要，找到水體中各類致嗅物質(zhì)與相關藻類的關系，深入研究藻類對環(huán)境、水質(zhì)的影響，從而更好地摸索出藻類致嗅物質(zhì)的控制方法，提升供水水質(zhì)。