不同激活比例和干預(yù)頻率富血小板血漿對大白兔 半月板損傷修復(fù)的效果研究

仇建軍 石文俊 鄒翰林 張磊

既往臨床認(rèn)為半月板是無功能的殘留物，但隨著運動醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，對半月板功能的認(rèn)識越來越深入，半月板的功能也被熟知[1]。半月板損傷是臨床上常見的關(guān)節(jié)損傷類型，近年越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)富血小板血漿(PRP)在半月板損傷修復(fù)中起到重要作用，但對于PRP的激活方式及比例、應(yīng)用方式、應(yīng)用頻率均無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[2]。本研究以大白兔為研究對象，分為Ⅰ期和Ⅱ期試驗，分析PRP不同激活比例和干預(yù)頻率對半月板修復(fù)的影響，進一步為臨床應(yīng)用PRP治療半月板損傷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年4月至2021年6月期間上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實驗室培養(yǎng)的成年健康大白兔68只作為研究對象，其中雄性大白兔35只，雌性大白兔33只，年齡1～2歲，平均年齡（1.4± 0.2）歲，體質(zhì)量為2.3～3.3 kg，平均體質(zhì)量（2.8± 0.3） kg。所有大白兔雙膝均建立半月板損傷模型，以關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP凝膠的右膝關(guān)節(jié)為試驗組，以關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不含PRP凝膠的左膝關(guān)節(jié)為對照組，進行Ⅰ期試驗和Ⅱ期試驗。

1.2 方法

1.2.1 半月板損傷建模

所有大白兔雙膝進行半月板損傷建模，麻醉后內(nèi)側(cè)入路切開內(nèi)側(cè)副韌帶做一長2 cm弧形的切口，沿髕骨內(nèi)側(cè)上緣至脛骨結(jié)節(jié)，切開所有皮膚和皮下組織。半月板拉鉤顯露出內(nèi)側(cè)半月板前角、體部和股骨踝軟骨面。采用刀片在內(nèi)側(cè)半月板游離緣做一長0.6 cm的縱行全層裂傷，術(shù)后縫合關(guān)節(jié)囊，肌注60萬單位青霉素以預(yù)防術(shù)后感染。

1.2.2 PRP凝膠制備

采集兔血標(biāo)本置入離心管旋轉(zhuǎn)離心，離心力200 g，離心時間10 min。離心結(jié)束后兔血呈上、下2層，上層為血清，下層為血漿，血清與血漿交界處有一薄層，即為富血小板。保留上層血清，交換血清下層1～2 mm處的紅細(xì)胞，去除含紅細(xì)胞的底層液體。以200 g的離心力對血清液體進行旋轉(zhuǎn)離心10 min，使血小板聚集在離心管底部。去除離心管內(nèi)大部分上層血清，約占血清總量的3/4。將剩余的血清液體搖勻，得到PRP。在PRP中加入激活劑，等待6～10 s，可形成PRP凝膠。

1.2.3 干預(yù)方法

Ⅰ期試驗：將36只大白兔右膝關(guān)節(jié)按隨機數(shù)字表法分為A、B、C 3組，每組各12膝，以大白兔左膝關(guān)節(jié)為對照組。A、B、C組大白兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射激活比例為3∶1、5∶1、7∶1的自體PRP凝膠，對照組大白兔左膝關(guān)節(jié)腔注射不含PRP的凝膠，每周注射1次，且均在注射后使用夾板固定膝關(guān)節(jié)2周。

Ⅱ期試驗：將32只大白兔右膝關(guān)節(jié)按隨機數(shù)字表法分為A、B、C、D 4組，每組各8膝，以大白兔相應(yīng)左膝關(guān)節(jié)為對照1、2、3、4組。A組僅進行1次右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)PRP凝膠注射治療，對照1組左膝關(guān)節(jié)腔注射1次不含PRP的凝膠；B組每周進行1次右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)PRP凝膠注射治療，對照2組左膝關(guān)節(jié)腔每周注射1次不含PRP的凝膠；C組每2周進行1次右膝關(guān)節(jié)腔PRP凝膠注射治療，對照3組左膝關(guān)節(jié)腔每2周注射1次不含PRP的凝膠；D組每4周進行1次右膝關(guān)節(jié)腔PRP凝膠注射治療，對照4組左膝關(guān)節(jié)腔每4周注射1次不含的PRP凝膠。所有大白兔注射的PRP激活比例均為7∶1，且在所有治療結(jié)束后進行夾板固定膝關(guān)節(jié)2周。

1.2.4 大白兔處理方法

Ⅰ期試驗：PRP凝膠治療后4、8、12周，每組分別以空氣栓塞的方式處死4只大白兔，取大白兔半月板，對半月板標(biāo)本采用10%甲醛固定液固定、洗滌、脫鈣、透明、透蠟、包埋等，制備成石蠟切片，蘇木精-伊紅染色（HE染色），在光學(xué)顯微鏡下觀察半月板的結(jié)構(gòu)情況。

Ⅱ期試驗：于PRP凝膠治療后第8周和第12周，每組分別處死4只大白兔，以空氣栓塞的方式處死大白兔，取大白兔半月板，將半月板標(biāo)本采用10%甲醛固定液固定、洗滌、脫鈣、透明、透蠟、包埋等，制備成石蠟切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察半月板的結(jié)構(gòu)情況。

1.3 觀察指標(biāo)

根據(jù)石蠟切片觀察Ⅰ、Ⅱ期試驗不同時期大白兔半月板損傷愈合情況。愈合等級評估標(biāo)準(zhǔn)[3]：Ⅰ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣整齊，無纖維組織增生，無幼稚成纖維細(xì)胞；Ⅱ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣新生膠原纖維，創(chuàng)緣可見軟骨細(xì)胞密度增大；Ⅲ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣內(nèi)有膠原纖維填充，但填充區(qū)域無纖維軟骨細(xì)胞或未形成軟骨陷窩；Ⅳ級為損傷區(qū)創(chuàng)緣內(nèi)存在大量膠原纖維填充，有少量纖維軟骨細(xì)胞或形成軟骨陷窩；Ⅴ級為切片無法辨認(rèn)創(chuàng)緣，纖維軟骨分布均勻。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ期試驗

2.1.1 4周時半月板愈合等級比較

Ⅰ期試驗4周時，A、B、C組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），3組與對照組半月板愈合等級差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 Ⅰ期試驗4周時半月板愈合等級比較/側(cè)

2.1.2 8周時半月板愈合等級比較

Ⅰ期試驗8周時，A、B、C組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），A、B組與對照組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），C組與對照組半月板愈合等級差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）（表2）。

表2 Ⅰ期試驗8周時半月板愈合等級比較/側(cè)

2.1.3 12周時半月板愈合等級比較

Ⅰ期試驗12周時，C組半月板愈合等級優(yōu)于A組、B組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組、B組與對照組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表3 Ⅰ期試驗12周時半月板愈合等級比較/側(cè)

A組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有膠原纖維組織填充，相互編織連接，但未發(fā)現(xiàn)纖維軟骨細(xì)胞，無軟骨凹陷形成（下頁圖1a）。B組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有膠原纖維組織填充，相互編織連接，有軟骨陷窩形成（下頁圖1b）。C組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有大量膠原纖維組織填充，相互編織連接，還有少數(shù)纖維軟骨細(xì)胞和軟骨陷窩形成（下頁圖1c）。對照組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)創(chuàng)面邊緣整齊，無明顯纖維組織增生，無幼稚成纖維細(xì)胞生成（下頁圖1d～f）。

圖1 Ⅰ期試驗12周時，HE染色（×100） a. A組 b. B組 c. C組 d～f. 對照組

2.2 Ⅱ期試驗

2.2.1 8周時半月板愈合等級比較

Ⅱ期試驗8周時，A、B、C、D組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；A、B、C、D組半月板愈合等級均優(yōu)于對照1、2、3、4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（下頁表4）。

表4 Ⅱ期試驗8周時半月板愈合等級比較/側(cè)

2.2.2 12周時半月板愈合等級比較

Ⅱ期試驗12周時，A、B、C、D 4組半月板愈合等級差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；4組半月板愈合等級均優(yōu)于對照1、2、3、4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表5）。

表5 Ⅱ期試驗12周時半月板愈合等級比較/側(cè)

A、B、C、D組HE染色顯示右側(cè)損傷區(qū)內(nèi)部有膠原組織填充，相互編織連接，偶有發(fā)現(xiàn)軟骨陷窩形成（圖2a～d）。對照1、2、3、4組HE染色顯示左側(cè)損傷區(qū)局部無明顯纖維組織增生，未發(fā)現(xiàn)幼稚成纖維細(xì)胞（圖2e～h）。

圖2 Ⅱ期試驗12周時，HE染色（×100） a. A組 b. B組 c. C組 d. D組 e. 對照1組 f. 對照2組 g. 對照3組 h. 對照4組

3 討論

PRP來源廣泛，制備簡單，且安全性較高，被臨床廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)，在肌肉、肌腱、韌帶、創(chuàng)面、骨損傷中均具有良好的應(yīng)用前景[4-5]。李朝暉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PRP具有損傷小、療程短、不易復(fù)發(fā)、安全性高等優(yōu)勢。史昱暉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PRP在緩解膝關(guān)節(jié)疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能方面具有較好效果，能明顯提高關(guān)節(jié)功能，改善患者生活質(zhì)量。因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PRP在修復(fù)關(guān)節(jié)損傷中也有良好效果[8-10]。

半月板是脛骨關(guān)節(jié)面上內(nèi)側(cè)和外側(cè)半月形狀骨，其血供局限于外側(cè)1/3，來源于半月板前后角韌帶滑膜套。半月板內(nèi)側(cè)1/3無毛細(xì)血管，因此內(nèi)側(cè)1/3又稱為無血運區(qū)，由于缺少血供，損傷后難以修復(fù)[11-13]。近年來越來越多的學(xué)者進行大量體外研究，發(fā)現(xiàn)采用PRP治療半月板損傷具有較好的修復(fù)作用[14-16]。但體內(nèi)實驗的結(jié)果卻不盡人意。臨床上對于PRP的激活方式、激活比例、應(yīng)用方式、應(yīng)用頻率等均無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此探究PRP的激活比例、應(yīng)用頻率等，有助于為臨床應(yīng)用PRP治療半月板損傷提供統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究對我院培養(yǎng)的大白兔雙膝進行半月板損傷建模，應(yīng)用不同激活比例和不同干預(yù)頻率分別進行Ⅰ期和Ⅱ期試驗。Ⅰ期試驗結(jié)果顯示，在治療4周后，3∶1、 5∶1以及7∶1的PRP激活比例治療半月板損傷效果并無明顯差異，A、B、C組與對照組治療效果也無明顯差異；治療后8周和12周時，C組半月板愈合等級明顯優(yōu)于A組、B組和對照組。究其原因，前4周治療效果不明顯可能是由于治療時間尚短，效果并不突出；治療后8周和12周，7∶1 激活比例的PRP對半月板損傷的修復(fù)效果較佳，明顯優(yōu)于3∶1和5∶1激活比例的PRP，提示7∶1 激活比例的PRP修復(fù)半月板損傷效果較好。Ⅱ期試驗結(jié)果顯示，無論治療8周還是12周，A、B、C、D組半月板愈合等級均無差異，且4組均優(yōu)于對照1、2、3、4組，結(jié)果提示不同干預(yù)頻率的PRP注射并不會影響PRP對半月板損傷的愈合效果，且對半月板損傷均具有較好修復(fù)效果。這可能是由于血小板源性生長因子體內(nèi)代謝及關(guān)節(jié)活動影響了組織修復(fù)[17]。

綜上所述，半月板損傷修復(fù)主要取決于PRP凝膠制備時的激活比例，7∶1的PRP凝膠對半月板損傷修復(fù)效果最佳。而PRP凝膠注射頻率對半月板的影響，仍然需要進一步深入研究。