USP39通過HMGA2調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制

李軍 劉小江 管誠 管義祥 丁錦榮

(南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 海安 226600)

惡性膠質(zhì)瘤是成人最常見的侵襲性和致死性原發(fā)性腦腫瘤〔1,2〕。盡管治療取得了巨大進(jìn)展，但惡性膠質(zhì)瘤患者的中位生存期為14.5～16.6個(gè)月〔3〕。目前主要治療方法是手術(shù)切除腫瘤為主，結(jié)合放療和化療，由于特征復(fù)雜，包括侵襲性生長和彌漫性侵襲，其治療效果欠佳，易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。近年來，許多研究工作集中在疾病的分子基礎(chǔ)上，目的是將這種更好的理解轉(zhuǎn)化為可行的治療方法〔4〕。

泛素特異性蛋白酶(USP)39是一個(gè)基于Dub結(jié)構(gòu)域序列相似性分類的去蛋白家族成員。由于Dub結(jié)構(gòu)域中沒有保守的活性位點(diǎn)殘基(半胱氨酸、組氨酸和天冬氨酸)，USP39完全喪失了去氫脫氮活性〔5〕。USP39在酵母中也被稱為Sad1p，在人類中被稱為65 kD SR相關(guān)蛋白，這兩種蛋白都與成熟剪接體復(fù)合體的組裝有關(guān)，表明在mRNA剪接中起作用〔6〕。以前的研究已經(jīng)證明USP39參與了極光激酶B轉(zhuǎn)錄的剪接〔5〕。斑馬魚USP39突變誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤mRNA剪接缺陷基因rb1〔7〕。據(jù)報(bào)道，USP39也是EGFR前mRNA剪接的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子〔8〕。目前，有研究報(bào)道USP39在胃癌、卵巢癌、乳腺癌等癌癥中異常表達(dá)，其促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)過程，包括增殖遷移、轉(zhuǎn)移和凋亡等〔9〕。USP39在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和生物學(xué)作用尚未闡釋清楚。高遷移率族蛋白(HMG)A2和蛋白或DNA發(fā)揮作用，繼而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮生物學(xué)功能〔10〕。在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)失調(diào)，屬于原癌基因，與腫瘤的惡性程度和分期預(yù)后具有相關(guān)性〔11,12〕。然而，USP39-HMAGA2在膠質(zhì)瘤中的作用尚未明確。本研究通過檢測膠質(zhì)瘤組織中USP39的表達(dá)，分析其與臨床病理因素之間的相關(guān)性，進(jìn)一步研究其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN18、U87MG、A172、U251、P3及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系(HA)均購自中國科學(xué)院(上海)。USP39和HMGA2抗體購于美國cell signaling公司。Matrigel是美國BD公司。Tanswell小室購于美國康寧。Lipofectamine 2000是美國Invitrogen。

1.2患者臨床資料分析 收集2018～2020年海安市人民醫(yī)院膠質(zhì)瘤組織及其癌旁正常組織各112例。統(tǒng)計(jì)分析所有患者的臨床病理資料，檢測USP39的表達(dá)水平，將112例患者分為USP39低表達(dá)組和USP39高表達(dá)組，分析兩組年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分期。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的同意。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞保持在37℃，在含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.4USP39干擾及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 針對USP39基因設(shè)計(jì)特異性siRNA。當(dāng)細(xì)胞A172和P3細(xì)胞貼壁密度達(dá)到70%左右時(shí)，接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到75%左右時(shí)，采用Lipofectamine 200轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將NC、敲降USP39轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5CCK-8檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞接種于96孔×5個(gè)培養(yǎng)皿中過夜。根據(jù)制造商說明，添加CCK-8溶液(Dojindo；日本熊本)以每24 h評估細(xì)胞活力。在微板閱讀器(PerkinElmer；加利福尼亞州圣何塞，美國)中，在450 nm處測量樣品。

1.6Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲 將細(xì)胞(2×104/孔)接種到transwell小室(孔徑：8 μmol/L；康寧的上腔中Costar；Tewksbury，MA，USA)和含有30%FBS(600 μl)的培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)箱在37℃下培養(yǎng)24～36 h，并固定細(xì)胞4%多聚甲醛，結(jié)晶紫染色(Solarbio；中國北京)。從每口井的5個(gè)隨機(jī)場(×100)獲得圖像。所有實(shí)驗(yàn)一式3份。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室內(nèi)加入Matrigel基質(zhì)膠，其余實(shí)驗(yàn)方法與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.7RT-PCR檢測組織和細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平 根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol試劑(Takara；日本東京)進(jìn)行細(xì)胞和組織RNA分離。分離的總RNA被量化，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo；大阪，日本)生成cDNA。mRNA水平用實(shí)時(shí)PCR定量。GAPDH作為內(nèi)部控制。采用以下引物：GAPDH上游引物：5′-GCACGTCAAGCTGAAAC-3′；下游引物：5′-TGGTGAAGAGCCAGAGGA-3′；USP39上游引物：5′-TGACCTCATTCATGCCACATCGT-3′；下游引物：5′-TTGCCTGTCCCATGATGAAGC-3′；HMGA2上游引物：5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′；下游引物:5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′。

1.8Western印跡檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞和組織在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解中溶解。離心取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白質(zhì)裂解物(20 μg)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在5%脫脂牛奶中封閉膜，并在4℃下用一級抗體孵育過夜，然后用二級抗體(ZSGB-BIO)孵育。使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore；Billerica，MA，USA)觀察膜上的蛋白質(zhì)。并使用Image J軟件(Bio-Rad)進(jìn)行量化。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1USP39在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)升高 qRT-PCR 檢測結(jié)果表明，USP39在112例膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織 (3.73±0.89 vs 1.18±0.53,t=26.052,P<0.001)。在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞P3、U87MG、U251、A172和LN18中的mRNA表達(dá)水平顯著高于HA細(xì)胞(P<0.05)。USP39在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞P3、U87MG、U251、A172和LN18中的蛋白表達(dá)水平顯著高于HA細(xì)胞(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 USP39在HA、P3、U251、U87MG、LN18和A172中細(xì)胞中mRNA蛋白的表達(dá)水平

圖1 USP39蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.2USP39表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理因素的相關(guān)性 USP39的表達(dá)與膠質(zhì)瘤分級具有相關(guān)性(P<0.001)。見表2。

表2 USP39表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征的相關(guān)性(n)

2.3敲降USP39抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖 為了進(jìn)一步研究USP39在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，我們在A172(NC組1.01±0.12，sh-USP39 0.34±0.16)和P3(NC組1.09±0.15，sh-USP39 0.37±0.16)細(xì)胞中通過慢病毒短發(fā)夾(shRNA)敲降USP39的表達(dá)。如圖2所示，轉(zhuǎn)染效率通過RT-PCR和Western印跡驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果成功。采用CCK-8檢測分析細(xì)胞增殖曲線的變化，如表3所示，敲降USP39后顯著抑制了A172和P3細(xì)胞的增殖能力。因此，敲降USP39抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

圖2 敲降USP39后細(xì)胞中USP39蛋白的表達(dá)

表3 不同時(shí)間各組細(xì)胞活性分析(450 nm OD值)

2.4敲降USP39抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲降USP39可以顯著抑制A172和P3細(xì)胞的遷移、侵襲能力，與對照組相比，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 敲降USP39抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲變化個(gè)，n=3)

2.5USP39調(diào)控HMGA2的表達(dá) 敲降USP39可以顯著抑制A172和P3細(xì)胞中HMGA2蛋白表達(dá)(0.32±0.07、0.29±0.08)，與對照組(0.97±0.09、1.03±0.07)相比差異顯著(P<0.05)。見圖4。

圖4 敲降USP39后細(xì)胞HMGA2蛋白表達(dá)

3 討 論

以往研究顯示，USP39有助于癌癥的進(jìn)展，并預(yù)測各種腫瘤的不良預(yù)后〔13,14〕。同時(shí)有研究表明USP39在多種癌癥中異常表達(dá)〔15,16〕。本研究發(fā)現(xiàn)USP39蛋白水平的升高與膠質(zhì)瘤分級有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)USP39促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移等生物學(xué)功能〔17～20〕。本研究結(jié)果證明敲降USP39后顯著抑制了A172細(xì)胞的增殖和遷移能力；過表達(dá)USP39有效地促進(jìn)了U251細(xì)胞的增殖和遷移能力。

HMGA2位于染色體12q13-15上，參與多種生物發(fā)育的生物學(xué)過程〔21〕。HMGA2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起到重要作用〔22〕。USP39調(diào)控下游的HMGA2，通過3′剪接位點(diǎn)改變剪接。過表達(dá)USP39可以使HMGA2的截?cái)嘈娃D(zhuǎn)錄升高。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)USP39可以顯著抑制HMGA2的蛋白表達(dá)。

綜上，在人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中USP39高表達(dá)，且能促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性腫瘤特性。因此，USP39在人類膠質(zhì)瘤發(fā)育過程中似乎具有致癌特性。本研究進(jìn)一步證明USP39的致癌活性是由于其能夠調(diào)控HMGA2。