特發(fā)性肺纖維化急性加重期患者NLRP3炎癥小體、炎癥因子、蛋白酶表達(dá)水平及其臨床價值

姜福富 覃綱 李嘉燕 張波 潘東旭 韋柳青

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧 530001)

特發(fā)性肺纖維化急性加重(AE-IPF)患者病情在短期內(nèi)急劇惡化，氣喘、呼吸困難等臨床癥狀急劇加重，急速肺衰竭，影像學(xué)表現(xiàn)為彌漫性磨玻璃影或?qū)嵶冇啊?，2〕。特發(fā)性肺纖維化患者每人每年急性加重的發(fā)生率約為4%，若將疑似患者考慮在內(nèi)時發(fā)病率增至20%〔3〕，則AE-IPF的病死率超過50%，預(yù)后極為兇險，給臨床診斷與治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)〔2〕。因此，探尋可有效預(yù)測AE-IPF患者預(yù)后的生物標(biāo)志物或手段對臨床早期進(jìn)行針對性干預(yù)以改善患者預(yù)后有著重要的臨床意義。研究證實多種炎癥因子如白細(xì)胞介素(IL)-1β及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9通過多種途徑參與肺纖維化的發(fā)生機制〔4，5〕，Lv等〔6〕通過實驗發(fā)現(xiàn)肺纖維化與Nod樣受體蛋白(NLRP)3炎癥小體活化有關(guān)，然而上述指標(biāo)與AE-IPF患者預(yù)后的相關(guān)研究未見提及?；诖?，本研究旨在探討AE-IPF患者NLRP3炎癥小體、炎癥因子、蛋白酶表達(dá)水平及其臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2019年5月在廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院收治的AE-IPF患者88例為AE-IPF組。其中男50例，女38例；年齡48～72歲，平均(60.40±10.50)歲。參照患者基線資料，選取同時期健康體檢者血液標(biāo)本100例為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院理論委員會批準(zhǔn)實施。納入標(biāo)準(zhǔn)：①IPF診斷均符合《特發(fā)性肺纖維化診斷和治療中國專家共識》〔7〕中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②明確的IPF史；③1個月內(nèi)發(fā)生典型的呼吸加重或急性惡化；④高分辨電子計算機斷層掃描(CT)檢查顯示兩肺在網(wǎng)狀影或蜂窩狀影等基礎(chǔ)上可見新的磨玻璃影、實變影；⑤無明確的肺部感染；⑥血氣分析等提示無機械通氣指征；⑦所有患者自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重的慢性阻塞性肺疾病、肺栓塞、支氣管哮喘、肺動脈高壓等其他肺部疾病者；②肺外病變者；③資料不完整；④伴有嚴(yán)重的內(nèi)分泌疾病、血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤者；⑤伴有嚴(yán)重的心、肝、腎等臟器疾病者；⑥不能完成隨訪者。

1.2檢測方法 取AE-IPF患者入院時和對照組體檢時空腹靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血管和常規(guī)管各3 ml。采用聚蔗糖(Ficoll)密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞并經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測NLRP3、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1，最后用2-△△Ct法計算NLRP3、Caspase-1的相對表達(dá)量。常規(guī)管內(nèi)外周血離心(3 000 r/min，15 min)后取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1β、MMP-9水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書(武漢賽默飛世爾科技公司)執(zhí)行。

1.3隨訪及分組 對所有AE-IPF患者進(jìn)行隨訪至2020年1月，中位隨訪時間為20個月，隨訪期間觀察患者疾病進(jìn)展情況、生存情況。剔除在隨訪期間篩查出結(jié)締組織疾病、非IPF原因?qū)е碌乃劳觥E-IPF診斷標(biāo)準(zhǔn)為IPF患者需同時滿足以下條件：①1個月內(nèi)發(fā)生典型的呼吸加重或急性惡化；②兩肺影像學(xué)檢查顯示在網(wǎng)狀影或蜂窩狀影等基礎(chǔ)上可見新的磨玻璃影、實變影；③無明確的肺部感染、肺栓塞或心力衰竭等；④低氧血癥加重。隨訪期間患者仍為生存狀態(tài)且未發(fā)生AE-IPF的歸為預(yù)后良好組(n=50)，反之為預(yù)后不良組(n=38)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗和χ2檢驗；使用受試者工作特征(ROC)曲線分析相關(guān)指標(biāo)對AE-IPF患者預(yù)后的預(yù)測效能。

2 結(jié) 果

2.1兩組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9表達(dá)比較 AE-IPF組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9均顯著高于對照組(P<0.001)。見表1。

2.2AE-IPF不同預(yù)后患者NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9表達(dá)比較 預(yù)后不良組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9均顯著高于預(yù)后良好組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9表達(dá)比較

2.3NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9預(yù)測AE-IPF患者預(yù)后ROC曲線 4者聯(lián)合預(yù)測的曲線下面積(AUC)，可見明顯優(yōu)于各單獨指標(biāo)(P<0.001)。見表2、圖1。

表2 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9預(yù)測AE-IPF預(yù)后的ROC曲線

圖1 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9預(yù)測AE-IPF預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

目前已發(fā)現(xiàn)的部分IPF相關(guān)生物標(biāo)志物，可能對疾病發(fā)展、患者預(yù)后有一定的風(fēng)險預(yù)示作用，然而IPF生物標(biāo)志物的研究仍為起步階段，多數(shù)報道的生物標(biāo)志物到臨床應(yīng)用仍需足夠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)〔8〕。對于AE-IPF這類高度異質(zhì)性疾病，尋找有效手段評估疾病發(fā)展及判斷預(yù)后是目前臨床急需解決的問題。NLRP3來自NLR家族，能夠特異性識別病原相關(guān)分子模式及損傷相關(guān)分子模式，被激活后作用于凋亡相關(guān)點狀蛋白(ASC)，誘導(dǎo)Caspase-1活化，形成蛋白復(fù)合物“炎癥小體”，促進(jìn)IL-1β的成熟與分泌。NLRP3炎癥小體已被證實在心、腎、肝臟及皮膚等器官纖維化的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥小體同樣在肺纖維化的早期炎癥反應(yīng)、中晚期成纖維細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)沉積過程中扮演著關(guān)鍵角色〔9〕。在IPF發(fā)生過程中，肺上皮細(xì)胞損傷引起中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞浸潤，促使轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、高遷移率族蛋白(HMG)B1、IL、MMP-9等因子的釋放，增加α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、膠原蛋白Ⅰ型的翻譯表達(dá)，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，加快細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而加速肺纖維化進(jìn)程〔10，11〕。NLRP3炎癥小體活化后，通過IL-1β調(diào)控TGF-β，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，促使細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌，加速基質(zhì)沉積，促進(jìn)肺纖維化〔12〕。此外，有研究表示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在成纖維細(xì)胞聚集及特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生與進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而NLRP3炎癥小體可能通過TGF-β對EMT進(jìn)行調(diào)節(jié)〔13〕。宋占帥等〔14〕通過動物模型發(fā)現(xiàn)，NLRP3及其下游因子Caspase-1、IL-1β、TGF-β1在肺纖維化肺組織中的表達(dá)均明顯上調(diào)，認(rèn)為NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號軸的激活參與了肺纖維化的發(fā)生與進(jìn)展。況菊等〔15〕發(fā)現(xiàn)，通過抑制NALP3炎癥復(fù)合體活化，可起到對成纖維細(xì)胞活化的抑制作用，從而起到抗纖維化作用。

MMP-9屬于MMPs家族成員之一，在健康肺組織中少量表達(dá)，當(dāng)機體受外界刺激時肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等均有表達(dá)，且在肺纖維化患者中MMP-9的活性及表達(dá)量均較正常人明顯增加〔16〕。特發(fā)性肺纖維化破壞性極強，加速上皮細(xì)胞活化，使肺泡間隔、肺泡腔的成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞數(shù)量快速增加，進(jìn)而引起細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積。在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，MMP-9表達(dá)異常升高、活性顯著增強，嚴(yán)重降解破壞肺泡-毛細(xì)血管基底膜，使肺泡上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起肺組織微環(huán)境發(fā)生改變，這種改變一方面刺激肌纖維膜母細(xì)胞、Ⅱ型上皮細(xì)胞等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，另一方面使纖維細(xì)胞由受損基底膜及受損上皮細(xì)胞間隙進(jìn)入肺泡，進(jìn)而生成膠原，導(dǎo)致肺泡纖維化〔17，18〕。在肺纖維化發(fā)展過程中，肺泡炎為起始中心環(huán)節(jié)，而MMPs則為肺纖維化急性快速進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)，肺纖維化急性發(fā)作患者的肺組織MMP-9的過度表達(dá)使肺泡-毛細(xì)血管的基底膜完整性受到嚴(yán)重破壞，并且激活TGF-β，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加速基質(zhì)沉積，促進(jìn)肺纖維化。

結(jié)果提示，AE-IPF患者血液NLRP3≥2.97時，預(yù)后可能不利，有一定的靈敏度和特異度；Caspase-1在其臨界值(2.90)時靈敏度較低，IL-1β取臨界值時則特異度較低，但MMP-9在其臨界值時的特異度較高。NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9聯(lián)合預(yù)測AE-IPF預(yù)后具有較高的靈敏度和特異度，有一定的臨床意義。由于本研究樣本量較小且隨訪時間較短，結(jié)果可能會產(chǎn)生一定偏倚，因此仍需擴大樣本量進(jìn)行更具前瞻性的研究并進(jìn)一步證實。